骨髓內(nèi)皮祖細胞自體移植治療冠心病的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是胚胎發(fā)育早期參與血管發(fā)生(Vasculogenesis)的最重要的干細胞。由于EPCs具有活躍的分化增生能力和不依賴于血管內(nèi)皮細胞(ECs)的成血管能力，因此可作為干細胞移植促血管新生治療的一種理想的細胞供體。尤其對于老年、糖尿病、高脂血癥等由于ECs功能受損而對細胞/生長因子反應低下的患者而言，其治療價值更為突出。但EPCs移植是一種個體化治療，細胞來源較少，即使通過體外培養(yǎng)擴增獲得的數(shù)量亦有限

2、，因此通過體外干預方法促進EPCs的生物學活性是提高其治療效能的關鍵手段。最新研究認為，微環(huán)境對于決定干細胞的命運比干細胞本身更重要[1]，微環(huán)境改變對干細胞的定向分化可能起到關鍵性作用，但同時也可能對干細胞的生長增殖和功能產(chǎn)生負面影響，這種“雙面”效應尚未引起研究者的足夠重視。還有的研究提示，心臟中存在固有的多能干細胞，并可能參與心臟損傷后的修復[2.3]，缺血再灌注條件下移植的EPCs和心臟固有的多能干細胞面臨著不同程度的缺血再灌注

3、損傷(IRI)，在該條件下的EPCs自體移植面臨移植時機選擇，EPCs預處理，以及EPCs移植后的在體標記觀察等急需解決的問題。本實驗旨在明確EPCs貼壁篩選方法的差異，結(jié)合以往研究報道美托洛爾可促進EPCs分泌VEGF，VEGFR表達上調(diào)；小腸RNA可以促進細胞生長和對機體損傷有一定的保護作用，通過觀察美托洛爾和小腸RNA對IRI條件下EPCs的增殖、分泌功能、生物學特征表達等方面的影響，探討其可能的機制，為臨床應用EPCs移植前的預

4、處理提供理論依據(jù)，并進行超順磁性氧化鐵顆粒(SPIO)標記EPCs，為EPCs移植后的活體示蹤研究和移植效果評價開創(chuàng)新方法。 實驗方法:(1)分別取小型豬和家兔骨髓，以Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞(MNCs)。采用加入豬重組VEGF和bFGF的EPCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代。對傳代細胞采用FACS分別標記抗CD133+、Ⅷ因子、CD31+及VEGFR-2。并檢測細胞分泌功能和增殖情況。(2)平行對照觀察24h貼壁和不貼

5、壁細胞誘導分化后的EPCs細胞增殖能力、分泌功能，生物學標志表達情況。(3)給予美托洛爾和小腸RNA，運用缺血模擬液模擬體內(nèi)缺血再灌注情況，通過細胞生長曲線，MTT，分泌功能，WesternBlotting等變化，觀察EPCs對缺血再灌注的耐受性，評價其干預效應。(4)建立急性心肌梗死動物模型：對提供骨髓的家兔，在其EPCs純化培養(yǎng)成功后開胸暴露心臟，結(jié)扎前降支第二對角支開口下0.5mm處，造成急性心肌梗死模型。(5)體外用SPIO標記

6、EPCs，觀察理想的標記濃度、成像效果、標記持續(xù)時間及標記對細胞生長的影響等。(6)用SPIO標記EPCs24h后，開胸于心肌梗死區(qū)域迷路注射EPCs，并通過核磁成像的方法在活體動態(tài)觀察移植后的變化，心電圖、B超、病理組織學檢查等方法評價移植效果。 實驗結(jié)果:(1)2種貼壁篩選方法均可以培養(yǎng)出EPCs。但經(jīng)免疫熒光染色鑒定及生物學特征等辨別，24h未貼壁細胞經(jīng)誘導后獲得的EPCs純度、成熟度、細胞功能和數(shù)量均優(yōu)于24h貼壁組和4

7、8h未貼壁組。(2)EPCs對缺血的耐受極限大約在3～4h；美托洛爾作用于EPCs的有效濃度約在1×10-6mol/ml左右；美托洛爾預處理組EPCs的Flk-1水平上調(diào)，EPCs凋亡較少，LDH和iNOS生成明顯低于單純?nèi)毖俟嘧⒔M和缺血再灌注后添加美托洛爾組，但高于正常對照組和單純美托洛爾處理組。(3)小腸RNA作用于EPCs的有效濃度約在20μg/ml左右，小腸RNA預處理可以上調(diào)EPCs的Flk-1，減少EPCs凋亡和LDH和i

8、NOS的生成。(4)缺血再灌注后即刻添加美托洛爾或小腸RNA反而對EPCs生長增殖產(chǎn)生不利的影響，尤其是RNA組。(5)SPIO體外標記EPCs的安全濃度大約在100μgFe/ml以下；高于此濃度，雖然成像效果更好，但會影響EPCs的正常增殖生長。較理想的標記濃度約在50μgFe/ml左右。體外標記成像可以持續(xù)4周以上。(6)EPCs的自體移植可以有效地促進心臟功能恢復，縮小心肌梗死區(qū)域，促進梗死區(qū)新血管形成。 結(jié)論:選擇24h

9、未貼壁細胞進行誘導分化可以獲得純度、成熟度較高，細胞功能較好的EPCs細胞群，而24h內(nèi)貼壁細胞更趨向于骨髓間充質(zhì)干細胞群，具有多向分化能力。對缺血的心肌和移植后再次缺血區(qū)域應在4h內(nèi)進行血流恢復，最大限度保護固有的多能干細胞和移植的EPCs。美托洛爾和小腸RNA預處理可以通過有效增強EPCs的VEGF和Flk-1表達，減少IRI條件下的細胞凋亡等機制對EPCs起到保護和促進增殖的作用，但不宜在缺血再灌注后即刻添加。EPCs自體移植可以