2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:用分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測志賀菌ipaH基因。 方法:根據(jù)GenBank上公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列,設(shè)計兩對引物和一條分子信標(biāo)探針。選取4株志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及大腸桿菌、腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌,4種細(xì)菌作陰性對照,進(jìn)行志賀菌ipaH基因特異性擴(kuò)增;根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果及序列分析結(jié)果,選定福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列第1236-1806位核苷酸目標(biāo)序列,進(jìn)行特異性擴(kuò)增,提取純化產(chǎn)物;將

2、純化好的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上,得到pGEM-T-ipaH重組克隆載體;擴(kuò)增pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒的菌液,送生物技術(shù)公司測序,與GenBank上公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因進(jìn)行核苷酸序列的比對;用無菌水按照10的倍數(shù)方法稀釋pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒,并得到梯度濃度的pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒;取不同濃度pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR及real-timePCR,根據(jù)實驗需要,選擇

3、不同退火溫度、Mg2+濃度、探針濃度,最終得出優(yōu)化后的real-timePCR反應(yīng)條件;隨后進(jìn)行靈敏度分析、構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)品、通過拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線;收集20份未知臨床腹瀉患者糞便樣本,進(jìn)行分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測志賀菌ipaH基因,為驗證實驗的可靠性,同時采用熒光終點(diǎn)法對20份未知臨床腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行熒光值測定。 結(jié)果:本實驗得出結(jié)果如下: 1.賀菌ipaH基因采用P1、P2和P3、P4

4、兩對引物,分別成功擴(kuò)增出571bp和150bp片斷,電泳結(jié)果顯示特異性好、靈敏度高。 2.福氏志賀菌ipaH基因片斷導(dǎo)入載體菌后,經(jīng)過測序證實與NCBI基因序列的同源性為99%。說明實驗用重組質(zhì)粒中含有ipaH基因571bp的片斷,可以作陽性標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建陽性模板。 3.選擇不同的退火溫度、Mg2+濃度、探針濃度,優(yōu)化real-timePCR反應(yīng)條件。 4.本實驗以10的倍數(shù)系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品為模板,P3、P4為上下游引

5、物,經(jīng)FTC2000熒光定量擴(kuò)增儀擴(kuò)增,靈敏度達(dá)到1.0×103copy/ml,經(jīng)實驗比較,比電泳法高1~2個數(shù)量級。通過計算機(jī)將Ct值與不同的濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值作圖,得出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,顯示Ct值和模板啟始濃度的拷貝數(shù)之間具有較好的線性關(guān)系(r=0.98)。 5.對20份未知的臨床腹瀉患者糞便樣本用分子信標(biāo)PCR技術(shù)檢測志賀菌ipaH基因,16份臨床腹瀉患者糞便樣本檢測有熒光信號,判斷結(jié)果為陽性,而其余4份臨床腹瀉患者糞便樣本無

6、熒光信號,判斷結(jié)果為陰性。檢測時間約4h。 6.采用熒光終點(diǎn)法檢測20份臨床腹瀉患者的糞便樣本,結(jié)果與real-timePCR檢測結(jié)果一致,驗證了分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測志賀菌ipaH基因的準(zhǔn)確性及可靠性。 結(jié)論:通過實驗本研究發(fā)現(xiàn): 1.異性ipaH基因是Shigella存在的直接標(biāo)志,與腹瀉有關(guān),是產(chǎn)生痢疾有關(guān)病癥的必要致病因子。 2.分子信標(biāo)熒光探針檢測志賀菌ipaH基因,其突出的優(yōu)點(diǎn)在于檢測

7、過程中特異性結(jié)合明顯高于其它常規(guī)核酸探針,敏感度高,定量檢測下限的指標(biāo)好。更有操作簡單、快速、防污染等特點(diǎn),是目前檢測志賀菌的有效方法。 3.采用real-timePCR和熒光終點(diǎn)法檢測20份臨床腹瀉患者的糞便樣本,結(jié)果一致。驗證了分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測志賀菌ipaH基因的準(zhǔn)確度及可靠性。 4.分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)是一種全新的PCR分子雜交模式,集PCR擴(kuò)增、熒光探針雜交、熒光檢測一體化??梢淮涡詸z測96份

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