基于vvhA基因TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的研究.pdf

1、吳增輝嚴(yán)杰教授背景和目的創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是革蘭陰性嗜鹽弧菌,廣泛存在于海產(chǎn)品中,尤以牡蠣中多見.創(chuàng)傷弧菌感染是新發(fā)傳染病之一,Thorsteinsson等(1974)首先報(bào)道了3例創(chuàng)傷弧菌引起的人類原發(fā)性敗血癥,1979年Farmer等予以命名.日本、北美和中東地區(qū)以及我國(guó)浙江、廣東、臺(tái)灣等沿海地區(qū)常有創(chuàng)傷弧菌感染的病例報(bào)告.創(chuàng)傷弧菌感染以原發(fā)性敗血癥和創(chuàng)口感染最為常見,此外還可引起胃腸炎、肺炎、腦膜炎、角

2、膜炎等.創(chuàng)口感染和原發(fā)性敗血癥發(fā)病急、進(jìn)展快,若不及時(shí)采取針對(duì)性治療措施,約50﹪創(chuàng)口感染患者須截肢以保全生命,50～80﹪原發(fā)性敗血癥患者發(fā)病后數(shù)天內(nèi)死亡.因此,創(chuàng)傷弧菌感染早期、快速診斷極為重要,但目前國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方法及其產(chǎn)品. 該菌分類上屬于弧菌屬第5群,分為三個(gè)生物型,其中Ⅰ型和Ⅲ型對(duì)人機(jī)會(huì)致病,Ⅱ型僅對(duì)鰻魚致病,Ⅲ型對(duì)人有強(qiáng)致病性.不同地區(qū)及病種患者標(biāo)本中分離的創(chuàng)傷弧菌染色體上均攜帶vvhA基因,故vvh

3、A基因是用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人類創(chuàng)傷弧菌感染的靶標(biāo).實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有快速、特異和敏感等優(yōu)點(diǎn),尤其適合于創(chuàng)傷弧菌感染臨床標(biāo)本檢測(cè)的需要.本研究在常規(guī)PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌vvhA基因的基礎(chǔ)上,建立了檢測(cè)'whA基因的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR.以指導(dǎo)臨床及時(shí)采取正確的應(yīng)對(duì)措施減少患者截肢和死亡率. 材料與方法：創(chuàng)傷弧菌臨床菌株WZ01株系溫州醫(yī)學(xué)院本課題組成員從患者標(biāo)本中分離并鑒定.使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(BioCol

4、or)提取細(xì)菌DNA,參考文獻(xiàn)以生物學(xué)軟件Primer Express設(shè)計(jì)針對(duì)vvhA基因的保守序列的引物和一條探針,分別以FAM和TAMRA標(biāo)記探針的5'端和3'端.通過pMD19-T載體與PCR擴(kuò)增所得的vvhA片段連接反應(yīng),形成重組質(zhì)粒pMDl9-T-vvhAl00,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMDl9-T-vvhAl00轉(zhuǎn)染感受態(tài)EcoliDH5a中.提取含有pMDl9-T-vvhAlOO重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒梯度稀釋濃度為1×10<'2>

5、～1×10<'7>作為陽性模板.通過對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)定來檢測(cè)方法的靈敏度;通過對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門菌、綠膿桿菌、志賀痢疾桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、霍亂弧菌的檢測(cè)來驗(yàn)證方法的特異性.由于創(chuàng)傷弧菌感染病人的臨床標(biāo)本不易獲得,為模擬臨床發(fā)生的創(chuàng)口感染和敗血癥實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建腹腔注射、皮下注射、灌胃三種方式感染創(chuàng)傷弧菌的ICR小鼠模型,以1×10<'5>CFU,1×10<'6>CFU and 1×10<'7>CFU三個(gè)創(chuàng)傷弧菌

6、的濃度去感染小鼠,運(yùn)用建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來檢測(cè)不同感染途徑小鼠的血液、腸內(nèi)容物、皮下感染組織標(biāo)本. 結(jié)果：設(shè)計(jì)的引物能夠很好的擴(kuò)增vvhA基因目的片段;為了獲得創(chuàng)傷弧菌vvhA基因TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽性對(duì)照,我們構(gòu)建了含vvhA基因100 bp目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒,測(cè)序結(jié)果表明所克隆的vvhA基因100 bp片段核苷酸序列與報(bào)道的相關(guān)序列相似性為100﹪,作為陽性對(duì)照實(shí)際使用時(shí)取得良好效

7、果.建立的vvhA基因TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR僅對(duì)創(chuàng)傷弧菌:DNA有陽性檢測(cè)結(jié)果,對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門菌、綠膿桿菌、志賀痢疾桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、霍亂弧菌DNA檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明該方法有較高的檢測(cè)特異性.為提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率及靈敏度,即獲得最小Ct值和最高△Rn值,我們采用矩陣法對(duì)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中所采用的引物和探針濃度比例進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的Ct值減少了5.51、ARn熒光強(qiáng)度由0

8、.6增長(zhǎng)至1.1左右.實(shí)驗(yàn)采用所建立的vvhA基因TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR,可有效地檢出可檢測(cè)出0.01 ng創(chuàng)傷弧菌DNA或1×10<'3>拷貝數(shù)pMD19-T-vvhAl00,不同濃度pMD19-vvhA100三次檢測(cè)結(jié)果的SD≤0.79,PCR僅可檢出1 ng創(chuàng)傷弧菌DNA或1×10<'5>及以上拷貝數(shù)pMD19-T-vvhA100.創(chuàng)傷弧菌小鼠感染模型檢測(cè)結(jié)果顯示腹腔感染組和皮下感染組小鼠在12小時(shí)內(nèi)死亡;灌胃感染組及對(duì)照