應用實時熒光定量PCR技術結合DNA直接測序技術檢測PINK1基因突變.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)異常等，病理以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的喪失和路易氏小體(Lewy Body)的形成為特點，約10-15﹪的PD患者有家族史。常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征(autosomal recessiveearly-onset parkinsonism，AREP)是指除符合帕金森病臨床診斷標準以外，遺傳方式呈常染色體

2、隱性遺傳，發(fā)病年齡≤45歲的帕金森綜合征；其發(fā)病可能與Parkin基因，PINK1基因，DJ-1基因和ATP13A2基因突變有關。多巴反應性肌張力障礙(Dopamine Reacted Dystonia，DRD)是指對小劑量左旋多巴有顯著性和持續(xù)性反應的肌張力障礙，其主要致病基因為GCH-1基因和TH基因。由于DRD臨床表現(xiàn)可能與發(fā)病年齡更早的AREP相似，其基因診斷和分子分型是必須的。 國內(nèi)外研究者對PINKJ1基因進行突變分

3、析，發(fā)現(xiàn)除點突變、小片段缺失或/和插入突變以外，還發(fā)現(xiàn)PINK1基因存在外顯子重排突變。對于呈雜合狀態(tài)的外顯子缺失突變及呈雜合或純合狀態(tài)的重復突變，DNA直接測序常常不能檢出，因此為全面檢測PINK1基因突變，目前國外普遍采用熒光定量PCR技術結合：DNA直接測序技術對PINK1基因進行突變檢測。目前國內(nèi)僅有張玉虎等用DNA直接測序法對PINK1基因進行突變檢測的報道，尚未見用實時熒光定量PCR技術檢測PINK1基因突變的報道。

4、 本文建立并應用實時熒光定量PCR檢測PINK1基因外顯子重排突變的技術平臺，結合DNA直接測序方法對本組21個AREP家系和6個DRD家系先證者進行PINK1基因突變分析。采用實時熒光定量PCR技術檢測PINK1基因外顯子重排突變，結合DNA直接測序技術檢測PINK1基因點突變、小片段插入或/和缺失突變。設置ALB基因為內(nèi)對照，建立PINK1基因和ALB基因的標準曲線，根據(jù)已建立的標準曲線計算PINK1基因和ALB基因相對于標準品的起

5、始拷貝數(shù)，PINK1基因相對拷貝數(shù)為PINK1基因相對起始拷貝數(shù)與ALB基因相對起始拷貝數(shù)的比值。結果應用實時熒光定量PCR技術對21個AREP家系和6個DRD家系先證者進行PINK1基因外顯子重排突變檢測，發(fā)現(xiàn)PINK1基因各外顯子相對拷貝數(shù)均在0.8-1.2之間，在目前公認的正常參考范圍之內(nèi)，提示本組患者不存在PINK1基因各外顯子的重排突變；在前期工作的基礎上，應用DNA直接測序法對5個AREP家系和3個DRD家系先證者進行PIN

6、K1基因點突變、小片段插入或/和缺失突變檢測，沒有發(fā)現(xiàn)PINK1基因的致病突變，發(fā)現(xiàn)5個單核苷酸多態(tài)(SNPs)：c．189C→T．c．1018G→A，c．1023G→A，c．1562A→C和3’-UTR37a→t，均為已報道SNPs。 研究結論：建立了應用實時熒光定量PCR檢測PINK1基因外顯子重排突變的技術平臺，未發(fā)現(xiàn)本組患者存在PINK1基因各外顯子重排突變；發(fā)現(xiàn)了本組患者PINK1基因的5個單核苷酸多態(tài)：c．189C→