人腦膠質(zhì)瘤化療耐藥及其逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：耐藥現(xiàn)象是影響膠質(zhì)瘤化療效果的重要因?yàn)?與相關(guān)耐藥基因的異常表達(dá)有關(guān)。明確耐藥基因與常用化療藥物之間的關(guān)系,并以此為靶點(diǎn),通過(guò)調(diào)節(jié)基因的功能,增加化療敏感性,從而實(shí)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn),是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究通過(guò)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)替莫唑胺(TMZ)和卡莫司汀(BCNU)化療耐藥的研究,分析耐藥產(chǎn)生的機(jī)理,探討維拉帕米(VRP)對(duì)化療耐藥逆轉(zhuǎn)的敏感性。
　　 方法：本研究分為四個(gè)部分。①膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)TMZ和BCNU

2、耐藥性分析:TMZ終濃度(單位:g/L)為0.00625,0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2；BCNU終濃度(單位:g/L)為0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5。細(xì)胞活性用MTT測(cè)定,細(xì)胞周期用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。②U251細(xì)胞對(duì)TMZ和BCNU多藥耐藥機(jī)理研究:細(xì)胞活性通過(guò)MTT來(lái)測(cè)定,細(xì)胞周期通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定；耐藥蛋白通過(guò)Western-blot和免疫組化檢測(cè)。③維拉帕米對(duì)U251細(xì)胞化療耐藥逆轉(zhuǎn)的體

3、外研究:細(xì)胞活性用MTT測(cè)定,細(xì)胞周期用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)；化療前后耐藥蛋白通過(guò)Western-blot和免疫組化檢測(cè)。④維拉帕米對(duì)U251細(xì)胞化療耐藥逆轉(zhuǎn)的體內(nèi)研究:建立U251細(xì)胞裸鼠皮下模型,腫瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量最大徑和最短徑。BCNU組劑量為25mg/kg,腹腔注射,每周一次,連續(xù)2周；BCNU+維拉帕米組,先給維拉帕米4mg/kg,5min后給BCNU,劑量和給藥方式與BCNU組相同。用免疫熒光染色測(cè)定P-gp、MRP1、LRP基

4、因表達(dá)。
　　 結(jié)果：①膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)TMZ和BCNU耐藥性分析:TMZ初始耐藥濃度為O.05 g/L,初始耐藥時(shí)間為第3天。BCNU初始耐藥濃度為0.2 g/L,初始耐藥時(shí)間為第2天。與空白對(duì)照組比較,TMZ和BCNU組中,處于GO/G1期細(xì)胞明顯增多(P<0.05)。②U251細(xì)胞對(duì)TMZ和BCNU多藥耐藥機(jī)理研究:U251細(xì)胞對(duì)BCNU和TMZ產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象；與空白對(duì)照組比較,BCNU和TMZ能誘導(dǎo)U251細(xì)胞被阻滯于

5、GO/G1期；Western-blot檢測(cè)顯示,與空白對(duì)照組比較,相關(guān)耐藥基因P-gP,MRP1,LRP表達(dá)均增加,其中P-gP,MRP1蛋白水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),MGMT在BCNU中表達(dá)增加,TMZ組中表達(dá)減少。免疫組化檢測(cè)顯示,使用BCNU前,LRP為陽(yáng)性,P-gp和MRP為陰性。使用BCNU后,LRP仍為陽(yáng)性,P-gp為弱陽(yáng)性,MRP1為陽(yáng)性。③維拉帕米對(duì)U251細(xì)胞化療耐藥逆轉(zhuǎn)的體外研究:VRP對(duì)TMZ和BCNU作用

6、U251細(xì)胞在某些時(shí)間點(diǎn)(BCNU在第3天,TMZ在第2、5、7天)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；VRP+TMZ、VRP+BCNU組與TMZ、BCNU比較,可以有效的將細(xì)胞抑制在GO/G1期(P<0.05)；Western-blot檢測(cè)顯示,與空白對(duì)照組比較,VRP組中基因P-gP、MRP1、MGMT表達(dá)減少；與TMZ、BCNU比較,VRP+TMZ、VRP+BCNU中P-gP、MRP1、MGMT表達(dá)減少,兩組中P-gP、MRP1比較分別

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與TMZ比較,VRP+TMZ中LRP增加,與BCNU比較,VRP+BCNU中LRP減少。免疫組化檢測(cè)顯示,加入VRP后,耐藥基因P-gP,MRP1,LRP的表達(dá)無(wú)明顯改變。④維拉帕米對(duì)U251細(xì)胞化療耐藥逆轉(zhuǎn)的體內(nèi)研究:與BCNU比較,BCNU+VRP在第1、2、3、4周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。免疫熒光染色檢測(cè)顯示,與BCNU比較,VRP+BCNU基因表達(dá)LRP陽(yáng)性,P-gp,MRP1為弱陽(yáng)性。

8、>　　 結(jié)論：①不同化療藥物不同濃度和作用時(shí)間對(duì)U251細(xì)胞化療具有不同的敏感性；②化療藥物通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的影響使膠質(zhì)瘤產(chǎn)生耐藥；③耐藥基因表達(dá)量和表達(dá)類型的改變,尤其是P-gp、MRP1,是多藥耐藥產(chǎn)生的因?yàn)橹?膠質(zhì)瘤的多藥耐藥現(xiàn)象是通過(guò)原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥共同作用的結(jié)果；④體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)表明,維拉帕米對(duì)TMZ、BCNU化療膠質(zhì)瘤具有一定的協(xié)同作用,維拉帕米可以競(jìng)爭(zhēng)性的與膜上的耐藥蛋白P-gp、MRP1結(jié)合,來(lái)逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤多藥耐藥的現(xiàn)象