人腦膠質(zhì)瘤模型中腫瘤血管壁的構(gòu)建及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：利用雙色熒光蛋白示蹤的人腦膠質(zhì)瘤模型探討腫瘤血管形成中的細(xì)胞融合問(wèn)題
　　目的：腫瘤血管生成被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的生物學(xué)現(xiàn)象，是決定疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素。已經(jīng)證實(shí)在體內(nèi)外人腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞參與血管形成，但具體機(jī)制未明，本實(shí)驗(yàn)旨在探討人腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞同宿主細(xì)胞相互融合在腫瘤血管形成中重要作用。
　　方法：采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的人腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞SU3-RFP，同宿主表達(dá)綠色熒光蛋白(

2、GFP)的裸小鼠構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤原位移植模型，用組織壓片、切片的方法，利用熒光顯微鏡和熒光掃描激光共聚焦顯微鏡觀察宿主正常腦組織和移植瘤組織中的血管形態(tài)和組成血管的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：在正常腦組織，壓片法可見(jiàn)到類(lèi)似于注射了血管造影劑樣清晰的各級(jí)血管的形態(tài)，并根據(jù)組織部位，可大致判斷血管的形態(tài)學(xué)特征；在腫瘤組織，壓片法可見(jiàn)到紅色的腫瘤血管，綠色的宿主血管，黃色的腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞共建的血管。在熒光掃描激光共聚焦顯微鏡下觀察腫瘤組

3、織冰凍切片，可分析血管壁的組織結(jié)構(gòu)，無(wú)論是內(nèi)皮細(xì)胞還是平滑肌細(xì)胞都可見(jiàn)由紅色的腫瘤細(xì)胞、綠色的宿主細(xì)胞和黃色的腫瘤與宿主共建細(xì)胞共同組成。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)基因熒光蛋白示蹤的可移植性膠質(zhì)瘤模型，在研究膠質(zhì)瘤血管形成時(shí)可清晰了解腫瘤組織中的宿主血管、腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞共建的血管。在共建血管，除了在同一根血管上可區(qū)分紅色腫瘤細(xì)胞與綠色宿主細(xì)胞鑲嵌排列的馬賽克血管,還能見(jiàn)到在同一個(gè)細(xì)胞，既表達(dá)RFP又表達(dá)GFP的雙陽(yáng)性(融合)細(xì)胞

4、，并且在腫瘤侵襲宿主周?chē)M織也見(jiàn)到這種反應(yīng),據(jù)此表明細(xì)胞融合是腫瘤血管形成的重要途徑。
　　第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞體外共培養(yǎng)研究腫瘤血管形成中的細(xì)胞融合問(wèn)題
　　目的：獲取自身表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的近交裸小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs，體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）并鑒定其生物學(xué)特性，同轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白（RFP）基因的人腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞SU3-RFP體外共培養(yǎng)探討兩種細(xì)胞融合反應(yīng)對(duì)腫瘤血管形成的

5、驅(qū)動(dòng)作用。
　　方法：體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）基因的裸小鼠MSCs，利用測(cè)CCK-8生長(zhǎng)曲線、集落形成實(shí)驗(yàn)、制備染色體、Rt-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞等技術(shù)觀察并鑒定骨髓間充質(zhì)細(xì)胞MSCs，取轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白（RFP）基因的人腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞SU3-RFP與轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）基因的綠色裸小鼠MSCs，進(jìn)行體外共培養(yǎng)，在熒光顯微鏡觀察融合細(xì)胞的增殖特性，并利用CCK-8生長(zhǎng)曲線、Rt-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、流

6、式細(xì)胞技術(shù)和轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)來(lái)研究融合細(xì)胞的生物學(xué)特性及形成腫瘤血管的能力。
　　結(jié)果：MSCs在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，高增殖活性基本不變，且表達(dá)CD105，不表達(dá)nestin、CD31，其生物學(xué)和遺傳學(xué)特征穩(wěn)定。隨著MSCs與SU3-RFP細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代次數(shù)的增加，RFP+/GFP+黃色融合細(xì)胞的比例明顯增加。經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選純化，RFP+/GFP+黃色融合細(xì)胞占83.7％±4.5%。其高增殖能力長(zhǎng)期保持不變，且通過(guò)Rt-