DNA修復(fù)基因MGMT沉默對(duì)人腦膠質(zhì)瘤化療的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類化療藥物產(chǎn)生抗藥性是化療失敗的一個(gè)主要原因。DNA修復(fù)酶—O6—甲基鳥(niǎo)嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine DNA methyltransferase，MGMT）在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)雙氯乙亞硝脲（Carmustine，BCNU）等亞硝脲類藥物的耐藥密切相關(guān)，并影響腫瘤的化療效果和病人的預(yù)后。探討通過(guò)特異性封閉MGMT基因，抑制MGMT mRNA的表達(dá)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)MGMT的目的，是MGM

2、T研究的熱點(diǎn)。目前MGMT基因治療的策略主要有：使用MGMT酶活性抑制劑、核酶技術(shù)、反義RNA技術(shù)。RNAi（RNA interference）技術(shù)是誘導(dǎo)基因沉默的一種新技術(shù)。RNAi自誕生以來(lái)，不僅應(yīng)用于基因功能分析，而且作為基因治療的一種方法，在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中獲得了較大進(jìn)展。 本課題從三個(gè)方面對(duì)MGMT進(jìn)行了系統(tǒng)研究：①M(fèi)GMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株中的表達(dá)及其與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化之間的關(guān)系；②構(gòu)建3條針對(duì)

3、MGMT的siRNA質(zhì)粒載體；③采用脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染T98細(xì)胞系，觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞中MGMT的表達(dá)情況及其對(duì)BCNU敏感性的變化。 第一部分 MGMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株中的表達(dá)及意義 目的：研究MGMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株中的表達(dá)及其與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化之間的關(guān)系。 方法：研究對(duì)象為13株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株、35例臨床膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織。采用美國(guó)Gentra公司的試劑盒以鹽析法提

4、取基因組DNA，并采用美國(guó)Chemicon公司CpGenomeTM DNA修飾試劑盒對(duì)組織DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，采用甲基化特異性PCR法（Methylation—specific PCR，MSP）進(jìn)行MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的檢測(cè)；采用sulforhodamine B（SRB）Colorimetric抗癌藥篩選法測(cè)定人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株對(duì)BCNU的敏感性；采用免疫組化的方法來(lái)檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織標(biāo)本中MGMT蛋白的表達(dá)程度。

5、 結(jié)果：13株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株中有8株存在MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，其中有7株對(duì)BCNU敏感，1株耐藥；其余5株為MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，均對(duì)BCNU耐藥。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析：P<0.05；按性別分組，男性患者的腫瘤組織MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為59.1%（13/22），女性患者的腫瘤組織MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為69.2%（9/13），男女兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；按年齡分組，≤53歲年齡組、>53

6、歲年齡組患者組織的MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為66.7%（12/18）、58.8%（10/17）。兩組間MGMT蛋白表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；按病理分級(jí)分組，病理分級(jí)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)患者組織的MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為100.0%（2/2）、53.8%（7/13）、61.1%（11/18）、100%（2/2），采用非參數(shù)多個(gè)獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；在

7、35例膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本中，22例MGMT蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤組織中7例組織MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，陽(yáng)性率為31.8%；13例MGMT蛋白表達(dá)呈陰性的膠質(zhì)瘤組織中11例組織MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，陽(yáng)性率為84.6%。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析：P<0.05。 結(jié)論：在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株中，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化與其對(duì)BCNU的敏感性相關(guān)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株對(duì)BCN

8、U敏感；膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系/株對(duì)BCNU耐藥。MGMT蛋白的表達(dá)與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)相關(guān)，與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別及病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性。MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化，MGMT蛋白表達(dá)較低；MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，MGMT蛋白表達(dá)較高。 第二部分 MGMT基因RNAi質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建MGMT基因的siRNA（small interfering RNA）質(zhì)粒

9、載體pRNAT—H1.1/Neo—MGMT siRNA，為進(jìn)一步研究siRNA對(duì)MGMT基因的抑制作用，探討MGMT在膠質(zhì)瘤的化療耐藥及逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥表型中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：針對(duì)MGMT的靶序列設(shè)計(jì)合成三條shRNA（small hair RNA）的DNA模板單鏈，同時(shí)模板鏈兩端分別設(shè)計(jì)BamHⅠ和HindⅢ限制酶切位點(diǎn)。退火形成siRNA載體插入片斷。用限制性內(nèi)切酶將pRNAT—H1.1/Neo線性化，T4連接酶將插

10、入片斷插入pRNAT—H1.1/Neo中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后培養(yǎng)出陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切、電泳和測(cè)序的方法鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。 結(jié)果：設(shè)計(jì)構(gòu)建三條針對(duì)MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體，經(jīng)雙酶切，在2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：PCR產(chǎn)物大小76bp，產(chǎn)物大小與設(shè)計(jì)的完全相同。測(cè)序結(jié)果證明序列正確。 結(jié)論：成功設(shè)計(jì)構(gòu)建了三條針對(duì)MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體，為研究RNA干擾逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥表型提供了

11、良好的實(shí)驗(yàn)材料。 第三部分 siRNA干擾MGMT基因表達(dá)的初步研究 目的：探討三條針對(duì)MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體逆轉(zhuǎn)T98細(xì)胞MGMT mRNA、MGMT蛋白表達(dá)及對(duì)BCNU敏感性的效果。 方法：通過(guò)LipofectimineTM2000將三條MGMT的siRNA質(zhì)粒載體及空載體分別轉(zhuǎn)入T98細(xì)胞中，以綠色熒光蛋白（GFP）基因?yàn)閳?bào)告基因，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和G418篩選4周后質(zhì)粒表達(dá)效

12、率。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Real—time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RQ—PCR）法測(cè)定MGMT mRNA的表達(dá)，Western Blot測(cè)定MGMT蛋白的表達(dá)。MTT法測(cè)定siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染前后T98細(xì)胞系對(duì)烷化劑BCNU的敏感性變化。 結(jié)果：在熒光顯微鏡下觀察：經(jīng)LipofectimineTM2000轉(zhuǎn)染的T98細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h，在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的綠色熒光

13、，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率分別為15.9%（siRNAl）、15.5%（siRNA2）、16.7%（siRNA3）、11.1%（陰性對(duì)照），4周后再次檢測(cè)質(zhì)粒表達(dá)率分別為81.1%（siRNA1）、79.6%（siRNA2）、88.1%（siRNA3）、86.1%（陰性對(duì)照）；由實(shí)時(shí)定量RT—PCR可知：三種MGMT siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染T98細(xì)胞后，其MGMT mRNA的表達(dá)受到抑制。相對(duì)陰性對(duì)照而言，siRNA2抑制

14、作用最為明顯，達(dá)到87%，siRNA1次之，為74%，siRNA3為65%；采用Western blot法對(duì)MGMT蛋白表達(dá)測(cè)定的結(jié)果顯示：干擾組（T98/MGMT siRNA1； T98/MGMT siRNA2； T98/MGMT siRNA3）MGMT蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯減少，MGMT蛋白的表達(dá)在干擾組間無(wú)顯著差異；采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T98細(xì)胞對(duì)BCNU的敏感性：轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒載體后，BCNU對(duì)T98細(xì)胞作

15、用的劑量一反應(yīng)曲線，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體T98細(xì)胞的曲線左移。未轉(zhuǎn)染的T98細(xì)胞對(duì)BCNU耐藥，其IC50為140.56μg/ml，而轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞其IC50分別為126.18μg/ml（陰性對(duì)照）、44.50μg/ml（siRNA1）、23.12μg/ml（s1RNA2）、56.87μg/ml（siRNA3）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒載體的T98細(xì)胞對(duì)BCNU的敏感性增加。 結(jié)論：LipofectimineTM2000在轉(zhuǎn)