U87-EGFRvⅢ細(xì)胞適配子的篩選及其介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的初步應(yīng)用.pdf

1、惡性多形性膠質(zhì)瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常見的惡性腦腫瘤，預(yù)后非常差:成年病人1、3或者5年的生存期的概率大約分別為＜30％、＜5％、＜3％。在20％～30％的GBM病人中存在人表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)及其常見的Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)的異常表達(dá)，有研究證明其表達(dá)變化與GBM的惡化及放、化療抗性有密切關(guān)系;在其它惡性腫瘤如非小細(xì)胞

2、肺癌、大腸癌、結(jié)腸癌等中均存在不同程度的EGFR及EGFRvⅢ的高表達(dá)。因此EGFR及其突變體可以作為腫瘤治療的主要靶標(biāo)。目前，EGFR單克隆抗體已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療，這種抑制劑阻斷EGFR受體，使得EGFR的酪氨酸激酶信號(hào)通路失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。由于抗體藥物本身的免疫原性，且EGFR在正常組織中也表達(dá)， EGFR單克隆抗體的應(yīng)用出現(xiàn)了許多不良反應(yīng)、長(zhǎng)期使用易出現(xiàn)耐藥性，因此開發(fā)靶向性強(qiáng)、免疫原性小、分子量小、毒性小、穩(wěn)定

3、好的制劑更為重要。另有研究表明EGFRvⅢ僅在腫瘤組織中表達(dá)，可作為高特異性的治療靶標(biāo);而核酸適配子技術(shù)的發(fā)展為新的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了可能。
　　 適配子(aptamer)是能形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，以高親和力和高特異性與靶分子結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配子有如下特征:分子量小，可在體外快速合成，易于化學(xué)修飾;穩(wěn)定性好便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存;毒性低，免疫原性小;有較快較好的組織滲透性。這些優(yōu)點(diǎn)使得適配子可用于疾病的診斷和治療

4、。適配子可通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX)在容量為1013-1015的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到。
　　 近幾年有研究報(bào)道篩選出更復(fù)雜靶分子的適配子，如細(xì)胞膜蛋白、全細(xì)胞和細(xì)菌等。相比protein-SELEX，基于細(xì)胞的cell-SELEX技術(shù)不需要純化或者固定靶分子蛋白，且靶分子或者靶蛋白能在活性狀態(tài)

5、下維持細(xì)胞表面正常的空間結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)，這樣易于篩選出腫瘤細(xì)胞表面的新的靶分子或靶蛋白，對(duì)腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)有重要意義。
　　 本研究利用cell-SELEX技術(shù)，以穩(wěn)定過表達(dá)EGFRvⅢ的U87細(xì)胞(U87-EGFRvⅢ細(xì)胞)作為靶分子，從體外合成的含30個(gè)隨機(jī)序列的寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞高親和力、高特異性結(jié)合的適配子。利用經(jīng)典ELISA的方法和生物素-鏈親和素系統(tǒng)，建立并進(jìn)行細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)(cellen

6、zyme-linked assay，cell-ELA)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定適配子與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力;利用共聚焦顯微鏡檢測(cè)技術(shù)尋找能被U87-EGFRvⅢ細(xì)胞表面受體介導(dǎo)內(nèi)吞的適配子，并用此適配子作為一種傳遞c-Met siRNA進(jìn)入細(xì)胞介導(dǎo)基因沉默的工具。
　　 首先，建立穩(wěn)定過表達(dá)EGFRvⅢ的細(xì)胞株U87-EGFRvⅢ，同時(shí)體外構(gòu)建合成兩端為固定序列、中間為30個(gè)nt的隨機(jī)序列、全長(zhǎng)為76個(gè)nt的ssDNA文庫(kù)。以貼壁

7、培養(yǎng)過夜的U87-EGFRvⅢ細(xì)胞為靶標(biāo)，經(jīng)過孵育、洗滌、分離后，通過不對(duì)稱PCR法分離單鏈ssDNA，大量擴(kuò)增得到下輪篩選的亞庫(kù)。篩選過程中不斷增加篩選的強(qiáng)度（如增加鮭精DNA量、縮短孵育時(shí)間、增加洗滌強(qiáng)度等）。從第四輪篩選開始，每輪引入EGFRvⅢ蛋白表達(dá)陰性的U87細(xì)胞作為反篩細(xì)胞，以去除細(xì)胞表面相同受體或者結(jié)構(gòu)的干擾，經(jīng)過14輪cell-SELEX篩選和鑒定，得到與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞高親和力、高特異性結(jié)合的適配子。

8、　　 用生物素標(biāo)記的上游引物對(duì)所篩選的亞文庫(kù)進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，得到生物素標(biāo)記的ssDNA。cell-ELA的方法檢測(cè)篩選亞文庫(kù)對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞和U87細(xì)胞的結(jié)合力，在細(xì)胞數(shù)目和投入的ssDNA的量相同的條件下測(cè)定吸收度，從而判斷出篩選過程中結(jié)合到U87-EGFRvⅢ細(xì)胞上的ssDNA的富集情況。
　　 將第14輪的篩選產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、純化、T載體克隆、“藍(lán)-白”斑篩選并測(cè)序，得到相應(yīng)適配子的序列，并用RNA STR

9、UCTURE5.2軟件預(yù)測(cè)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并將這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，根據(jù)序列的相似性挑選出進(jìn)行后續(xù)功能研究的適配子。
　　 為了鑒定適配子的特異性和親和力，用FITC標(biāo)記適配子，然后與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞孵育結(jié)合，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況;用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定各個(gè)FITC標(biāo)記的適配子與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和特異性;建立基于適配子的cell-ELA檢測(cè)方法，測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)，在Sigmaplot12.0軟件中通過非線性回歸分

10、析獲得適配子的解離常數(shù)。
　　 共聚焦顯微鏡定位觀察適配子與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，尋找能被細(xì)胞膜受體內(nèi)吞的適配子。以鏈親和素磁珠-pull down實(shí)驗(yàn)尋找適配子的具體分子靶標(biāo)，即鏈親和素磁珠和生物素標(biāo)記的適配子孵育后，再與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞蛋白提取物孵育。此時(shí)，與生物素標(biāo)記的適配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-適配子復(fù)合物上，通過SDS-PAGE膠分離，在PVDF膜上用EGFR抗體來顯影，若適配子能與EGF

11、RvⅢ受體結(jié)合并發(fā)生作用，那么顯影的結(jié)果將會(huì)有EGFRvⅢ蛋白145KD條帶。驗(yàn)證此種適配子能介導(dǎo)c-Met siRNA的傳遞從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)來抑制c-Met基因的表達(dá)。用脂質(zhì)體lipofectamine2000轉(zhuǎn)染siRNA作為對(duì)照，Western blot實(shí)驗(yàn)分析c-Met蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果顯示:隨著cell-SELEX篩選輪數(shù)的增加，ssDNA亞庫(kù)與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞結(jié)合的吸收度逐漸增加，第12輪、14輪與原庫(kù)

12、相比吸收度升高，有顯著性差異(P＜0.05)。至第14輪，ssDNA與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的結(jié)合達(dá)到基本飽和狀態(tài)，說明ssDNA文庫(kù)在14輪已有一定的富集程度。將14輪得到的ssDNA克隆測(cè)序，序列用RNA Structure5.2軟件分析:克隆測(cè)序結(jié)果中序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)都以莖環(huán)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)為主，其中共有10個(gè)序列出現(xiàn)兩次以上的重復(fù)。在這10個(gè)序列中隨機(jī)挑出5個(gè)序列(A41、A43、A32、A47、A15)進(jìn)行FITC熒光或者生物素標(biāo)記

13、后進(jìn)一步分析。
　　 在熒光顯微鏡下觀察序列與U87-EGFRvⅢ、U87以及HEK293三種細(xì)胞的結(jié)合情況，在U87-EGFRvⅢ細(xì)胞中觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，而其它細(xì)胞均觀察不到熒光。觀察發(fā)現(xiàn)FITC標(biāo)記的適配子A41、A32的綠色熒光集中在U87-EGFRvⅢ細(xì)胞核內(nèi)，與DAPI的藍(lán)色光重合。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一觀察結(jié)果，用共聚焦顯微鏡觀察A43、A41、A32、A47適配子在U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的定位，確認(rèn)A41、A32的

14、熒光主要聚集在細(xì)胞核中，而其它適配子的熒光主要集中在細(xì)胞膜的表面。初步推測(cè)A41、A32適配子入核的原因可能是被細(xì)胞膜蛋白EGFRvⅢ或者其它膜受體內(nèi)吞所致。Cell-ELA方法測(cè)定適配子A43、A41、A32、A47、A15的解離常數(shù)值(Kd)分別為:4.40±0.27nM，37.57±6.01nM，0.62±0.04nM，3.33±0.39nM，14.09±2.95。解離常數(shù)均在100nM范圍內(nèi)，其中A32的親和力最高，其親和力接近

15、同體系測(cè)定的EGFR抗體對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力(Kd=0.32±0.07 nM)。通過pull-down實(shí)驗(yàn)及Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，與A32結(jié)合的靶標(biāo)為U87-EGFRvⅢ細(xì)胞中的EGFRvⅢ蛋白。
　　 較多研究報(bào)道GBM病人中c-Met的過表達(dá)或異常表達(dá)與腫瘤的惡化和預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤標(biāo)志物c-Met是酪氨酸激酶受體，其主要的配基為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，HGF/c-Met不僅可以影響胚胎組織的發(fā)育

16、和分化，而且可以通過細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附性、細(xì)胞遷移侵襲及抗凋亡的改變而導(dǎo)致致瘤性、侵襲性增強(qiáng)，腫瘤血管生成加速。c-Met在復(fù)發(fā)性GBM(15/19)中的表達(dá)量明顯高于原發(fā)性GBM（7/19，p=0.020）。復(fù)發(fā)性GBM病人中可觀察到c-Met的高表達(dá)。
　　 鑒于上述發(fā)現(xiàn)，由于A32具有較高的親和力和特異性，且初步認(rèn)定其與U87-EGFRvⅢ結(jié)合的位點(diǎn)為EGFRvⅢ受體并能進(jìn)入細(xì)胞。選擇生物素標(biāo)記的A32、生物素標(biāo)記的c-M

17、et siRNA、鏈親和素三者連接進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染c-Met siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染48h、72h之后收集細(xì)胞進(jìn)行Westemblot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48 h后，c-Met siRNA終濃度為40 nM和80 nM時(shí)，A32非轉(zhuǎn)染組和lipofectamin2000轉(zhuǎn)染組中c-Met的蛋白表達(dá)量均未有明顯下降，而在轉(zhuǎn)染48 h后，c-Met siRNA終濃度為100 nM時(shí)，與陰性對(duì)照siRNA組相比，lipo

18、fectamin2000轉(zhuǎn)染組（不加鏈親和素）中c-Met的表達(dá)量明顯減少，有顯著性差異（0.524±0.04，p=0.08），lipofectamin2000轉(zhuǎn)染組（加鏈親和素）中c-Met的表達(dá)量明顯減少（0.631±0.08，p=0.051）;c-Met siRNA投入終濃度為100nM時(shí)，72h干擾后，A32轉(zhuǎn)染組中c-Met的表達(dá)量減少明顯，與陰性對(duì)照siRNA組比有顯著性差異（0.57±0.09，p=0.039），陽(yáng)性對(duì)照組

19、lipofectamine2000（不加鏈親和素/加鏈親和素）組中c-Met表達(dá)量也顯著下降(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)證明:適配子A32能介導(dǎo)c-Met siRNA的傳遞進(jìn)入U(xiǎn)87-EGFRvⅢ細(xì)胞并引起c-Met基因沉默，從而影響c-Met蛋白的表達(dá)。可能由于適配子能在受體的內(nèi)吞作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并在鏈親和素的作用下與siRNA連接起來并進(jìn)入胞內(nèi)來發(fā)揮siRNA作用，從而介導(dǎo)c-Met的基因沉默。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示適配子、鏈親和素、siRNA三者