靶向大鼠IL-15Rβ亞基的siRNA的篩選及聚乙烯亞胺介導(dǎo)的siRNA動載體系的初步研究.pdf

1、目的：
　　IL-15在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)生發(fā)展中起重要作用，它誘使巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞在病變關(guān)節(jié)聚集、活化，活化的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞又進(jìn)一步產(chǎn)生IL-15及其它一系列細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷，因此阻斷IL-15信號通路進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的活化和炎癥因子的產(chǎn)生是治療RA的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)篩選能有效沉默大鼠IL-15受體β亞基(IL-15Rβ)表達(dá)的siRNA，制備并初步評價聚陽離子脂質(zhì)體PEI介導(dǎo)的siRN

2、A運(yùn)載體系的物理特性和生物學(xué)行為，為IL-15RβsiRNA治療RA積累數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　設(shè)計6對靶向IL-15Rβ基因的siRNA序列，分別以終濃度40nM體外轉(zhuǎn)染大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以實(shí)時定量PCR和Western檢測IL-15Rβ mRNA及蛋白的表達(dá)水平，篩選出具有最佳干擾效果的siRNA。siRNA與PEI分別以N/P比6、7、8結(jié)合，經(jīng)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測兩者結(jié)合情況，然后對最佳N/P比的PEI/siRNA復(fù)合物

3、進(jìn)行表征，測定其粒徑、zeta電位，最后以流式檢測體外巨噬細(xì)胞對該復(fù)合物的攝取情況。以完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)制備大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型，cy3標(biāo)記的siRNA與PEI以最佳N/P比結(jié)合形成復(fù)合物經(jīng)靜脈注射至RA大鼠體內(nèi)(1μg/g體重)，在8小時、24小時兩個時間點(diǎn)處死大鼠取血液、脾臟、肝臟、腳爪并分離標(biāo)記出其中的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，流式檢測siRNA被體內(nèi)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞攝取的情況，分析評價PEI對siRNA的體內(nèi)運(yùn)輸效果。

4、
　　結(jié)果：
　　6對siRNA中篩選到序列siRNA1562對IL-15Rβ mRNA表達(dá)水平的干擾效率最高，為85.87％，western結(jié)果表明該序列也能有效抑制IL-15Rβ蛋白表達(dá)；N/P比為6時PEI能夠完全結(jié)合siRNA形成帶正電的復(fù)合物，該復(fù)合物能被體外巨噬細(xì)胞攝取，流式結(jié)果表明巨噬細(xì)胞對該復(fù)合物的攝取率達(dá)到52.68％；在RA大鼠的血液、脾臟、肝臟、腳爪內(nèi)，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對siRNA的攝取率偏低。

5、　　結(jié)論：
　　1.成功篩選出能夠有效沉默大鼠IL-15Rβ表達(dá)的siRNA序列；
　　2.體外條件下，siRNA與PEI以N/P比6形成的復(fù)合物能夠充分結(jié)合siRNA，復(fù)合物顆粒平均大小246.44nm，電荷28.39mV，這種PEI/siRNA復(fù)合物能被巨噬細(xì)胞有效攝?。?br>　　3.成功制備了大鼠佐劑型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型；
　　4.現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下PEI/siRNA復(fù)合物在RA大鼠體內(nèi)被巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞攝取的效率