體外SELEX技術(shù)篩選SpA適配子的研究及初步應(yīng)用.pdf

1、[目的]：
　　 SpA是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子，它在金葡菌抗吞噬細(xì)胞吞噬、誘導(dǎo)分泌天然抗體的B細(xì)胞凋亡、引起葡萄菌性肺炎、心內(nèi)膜炎等方面發(fā)揮重要作用。本研究旨在利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，以磁珠結(jié)合的SpA作為靶分子，從體外合成的96個(gè)nt的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與SpA高親和力、高特異性結(jié)合的適配子；并建立生物素標(biāo)記適配子SpA的ELISA的檢測(cè)方法；尋找抑制SpA功能位點(diǎn)適配子，達(dá)到控制金黃色葡萄

2、球菌毒力的效果。
　　 [方法]：
　　 1.將SpA包被于Dynal磁珠，并用BCA法檢測(cè)SpA的包被效率，用免疫吸附法檢測(cè)SpA包被磁珠后結(jié)構(gòu)是否改變。
　　 2.在體外構(gòu)建兩端為固定序列、中間為60個(gè)nt的隨機(jī)序列、全長(zhǎng)96個(gè)nt的寡核苷酸文庫(kù)，以磁珠包被的SpA為靶標(biāo)，以磁力架分離結(jié)合與未結(jié)合的ssDNA，通過(guò)不斷增加篩選的強(qiáng)度(增加tRNA量、縮短結(jié)合時(shí)間、增加震蕩頻率等)，經(jīng)SELEX篩選，篩選與Sp

3、A高親和力、高特異性結(jié)合的適配子。
　　 3.反篩：在第7輪、第9輪和第12輪篩選前，用ssDNA文庫(kù)與空白磁珠結(jié)合，以未與空白磁珠結(jié)合的ssDNA文庫(kù)做為篩選庫(kù)，與SpA包被磁珠結(jié)合，以除去與SpA非特異性結(jié)合的ssDNA。
　　 4.用熒光集團(tuán)標(biāo)記ssDNA作為篩選文庫(kù)，應(yīng)用TBS-380熒光定量?jī)x測(cè)定2、4、6、7、9、10、11、12輪總投入庫(kù)與未與SpA結(jié)合的ssDNA的熒光值，計(jì)算出各輪總投入庫(kù)和篩選后與Sp

4、A結(jié)合的ssDNA量，觀察ssDNA的富集情況。
　　 5.將最后一輪篩選產(chǎn)物分別進(jìn)行擴(kuò)增、純化、TA克隆、“藍(lán)-白”斑選擇、測(cè)序，得到適配子的核酸序列，并用相關(guān)軟件分析適配子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，了解適配子的各結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并根據(jù)序列相似性和自由能挑選適配子家族。
　　 6.用Dot-blot方法測(cè)定適配子家族與SpA的結(jié)合情況。
　　 7.生物素標(biāo)記適配子，根據(jù)SpA-適配子-生物素-親合素-堿性磷酸酶-底物結(jié)合反應(yīng)步

5、驟，用適配子ELISA方法測(cè)定不同濃度適配子與SpA的結(jié)合情況，并用GraphPadPrism軟件通過(guò)非線性回歸分析獲得適配子的解離常數(shù)。
　　 8.將適配子標(biāo)記膠體金顆粒，將靶物質(zhì)點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜，用斑點(diǎn)免疫金滲濾法分析適配子與SpA結(jié)合的特異性。
　　 9.建立適配子ELISA檢測(cè)SpA方法，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 10.建立SpA結(jié)合的磁珠IgG吸附方法，觀察適配子對(duì)SpA與IgG結(jié)合的抑制。
　　

6、 11.從細(xì)胞學(xué)角度，根據(jù)細(xì)菌或SpA刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8和P38磷酸化特性，觀察適配子對(duì)金黃色葡萄球菌和SpA的抑制情況。
　　 12.用小鼠做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察適配子作用下，金黃色葡萄球菌感染小鼠肺炎、菌血癥、死亡等事件發(fā)生情況，觀察金黃色葡萄球菌感染或SpA作用小鼠，肺內(nèi)白細(xì)胞的募集情況。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.SpA高效率包被磁珠，包被效率為88.18％；并且包被后不影響SpA與IgG結(jié)合。

7、　　 2.隨著篩選輪數(shù)的增加，ssDNA富集庫(kù)與SpA結(jié)合的熒光值逐漸增加，第十二輪篩選獲得的富集庫(kù)與SpA結(jié)合率45.6％是第一輪2.1％的21.7倍。到第九輪，ssDNA富集庫(kù)與SpA的結(jié)合達(dá)到基本飽和狀態(tài)時(shí)，吸附到SpA上的ssDNA不再增加。
　　 3.48個(gè)克隆序列結(jié)果顯示，共有45個(gè)菌落得到結(jié)果，根據(jù)軟件分析，所有序列二級(jí)結(jié)構(gòu)都以莖環(huán)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)為主，根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)，共挑選出五個(gè)家族做進(jìn)一步分析。各家族間同源性大都在

8、70％以下。
　　 4.經(jīng)Dot-blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第一、第二、第三適配子家族與SpA結(jié)合的陽(yáng)性結(jié)果最強(qiáng)。進(jìn)行親和力測(cè)定，四個(gè)家族的Kd值分別為：17.31±6.24mM；25.22±7.51nM、24.27±6.98nM、53.18±7.58nM；通過(guò)膠體金滲濾法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第一、第二、第三家族均與SpA特異性結(jié)合。
　　 5.通過(guò)用生物素標(biāo)記適配子，建立了第二家族適配子ELISA方法，并建立了SpA做定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

9、。
　　 6.通過(guò)免疫吸附抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第一家庭適配子可以明顯抑制IgG與SpA的結(jié)合，使SpA結(jié)合IgG的比例從35.0％降至10.7％。
　　 7.金黃色葡萄球菌或SpA與表皮細(xì)胞TNFR作用促進(jìn)P38磷酸化，并最終導(dǎo)致細(xì)胞IL-8分泌增加，加入第一家族適配子后，細(xì)菌作用下細(xì)胞IL-8濃度從971.67±359.40pg/ml減少到487.08±189.09pg/ml(P=0.0013)，SpA作用下細(xì)胞IL-8濃度

10、從778.08±278.52pg/ml減少到255.58±136.76pg/ml(P<0.0001)。表皮細(xì)胞P38磷酸化增加。
　　 8.小鼠金黃色葡萄球菌感染模型中，同時(shí)加入適配子與細(xì)菌或適配子與SpA使小鼠肺炎、菌血癥發(fā)生率明顯下降，分別從58.33下降到16.67(肺炎)(p=0.0429)和25％(菌血癥)(p=0.0316)，肺內(nèi)白細(xì)胞募集情況也得到改善，分別從58.08％±30.55％下降到29.83％±16.44

11、％(細(xì)菌)(P<0.0001)；從34％±9％下降到16％±5％(SpA)(p=0.0028)。
　　 [結(jié)論]：
　　 本研究運(yùn)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，用磁珠做為分離體系，用排除非特異結(jié)合的反篩，經(jīng)十二輪篩選，在國(guó)內(nèi)、外最先篩選出針對(duì)SpA的ssDNA適配子，并首次運(yùn)用DOT-BLOT方法測(cè)定適配子與SpA的結(jié)合，建立SpA的適配子檢測(cè)方法。本研究還找到了SpA功能抑制適配子，初步證明了適配子對(duì)Sp