單核細(xì)胞增生性李斯特菌適配子的篩選及其初步應(yīng)用.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌)是一種胞內(nèi)寄生菌，在自然環(huán)境中廣泛存在，且對(duì)不良環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，甚至在4℃也能生長(zhǎng)繁殖，可以污染多種食品導(dǎo)致食源性疾病，其致死率高達(dá)20％以上，因此受到世界范圍的普遍關(guān)注，各國(guó)政府都制定了嚴(yán)格的防控措施和食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)。單增李斯特菌檢測(cè)方法可分為4大類:分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)和儀器分析法。其中免疫學(xué)方法在微生物快速檢測(cè)中的地位毋庸置疑

2、，它主要以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，因此抗體是免疫學(xué)方法中的核心試劑。但是免疫學(xué)方法使用過(guò)程中人們發(fā)現(xiàn)了抗體存在的一些不足，例如生物抗體存在獲取耗時(shí)、不易保存、批次不穩(wěn)定等缺陷。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種與抗體具有相似功能的新型配體---適配子。它相比于生物抗體具有便于修飾、性質(zhì)穩(wěn)定、可以無(wú)限合成等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。許多研究證明適配子有望替代生物抗體應(yīng)用于臨床治療和微生物檢測(cè)技術(shù)。
　　本文通過(guò)篩選

3、獲得能夠與單增李斯特菌特異性結(jié)合的ssDNA適配子，并采用酶聯(lián)配體吸附法(Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay,ELASA)對(duì)適配子應(yīng)用于檢測(cè)方法的能力進(jìn)行了初步探索。首先體外合成全長(zhǎng)為85bp的ssDNA文庫(kù)，該ssDNA兩端為引物序列，中間含有40bp隨機(jī)序列。以單增李斯特菌為靶標(biāo)，采用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic Evolution of Ligandsby Exponential

4、 Enrichment，SELEX）技術(shù)從ssDNA文庫(kù)中篩選能與單增李斯特菌特異性結(jié)合的ssDNA，共進(jìn)行15輪篩選。每輪篩選的次級(jí)文庫(kù)利用親和素標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增，以鏈霉親和素磁珠回收目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)每輪篩選的次級(jí)文庫(kù)利用地高辛標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與單增李斯特菌結(jié)合，通過(guò)抗地高辛抗體堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)測(cè)定次級(jí)文庫(kù)與單增李斯特菌的結(jié)合力，以O(shè)D405nm表示。結(jié)果顯示鏈霉親和素磁性微球可以有效回收目的DNA，提高篩選效率。s

5、sDNA與單增李斯特菌的結(jié)合力從第1輪的OD405nm為0.051逐步提高，到15輪篩選之后OD405nm提高到0.69。通過(guò)對(duì)獲得的適配子克隆測(cè)序獲得了23條適配子序列，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)適配子的一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性不高，最長(zhǎng)的有7個(gè)堿基同源。通過(guò)RNAstructure軟件對(duì)23條適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性可以分為4個(gè)家族。23條適配子與單增李斯特菌的親合力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示結(jié)合能力較高的6條適配子中有4條屬于第4家

6、族。選取21號(hào)和35號(hào)適配子與其它單增李斯特菌反應(yīng)，結(jié)果顯示21號(hào)和35號(hào)適配子具有較好的特異性。
　　選取親和力較強(qiáng)的適配子建立夾心ELASA來(lái)檢測(cè)單增李斯特菌。親和素標(biāo)記的適配子與鏈霉親和素結(jié)合被吸附到酶標(biāo)板上，作為捕獲配體，加入待檢樣品，洗滌后加入另一條親和素標(biāo)記的配體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合，加入TMB底物進(jìn)行顯色，測(cè)定OD450nm。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示鏈霉親和素以6μg/mL采用干法

7、包被酶標(biāo)板效果較好，捕獲適配子的濃度為40nmol達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)最佳顯色時(shí)間為15min。將培養(yǎng)的細(xì)菌液作10倍倍比稀釋后測(cè)定該方法的靈敏度，結(jié)果顯示該方法對(duì)單增李斯特菌最低檢測(cè)濃度為104CFU/mL。用ELASA法檢測(cè)李斯特菌屬內(nèi)和非李斯特菌屬的細(xì)菌，結(jié)果顯示以P/N值≥2.1作為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，可以特異地檢測(cè)單增李斯特菌。并用該方法檢測(cè)人工污染牛奶樣品，通過(guò)8h的增菌，可以檢測(cè)出單增李斯特菌。
　　本研究通過(guò)SELEX篩