重組人FcγRI核酸適配子的體外篩選及其在膿毒血癥實驗診斷中的應用研究.pdf

1、目的:
　　以重組人FcγRI胞外段蛋白作為靶分子，應用指數富集配基的系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技術，從體外合成組合化學的96 nt隨機ss DNA核酸文庫中篩選出人FcγRI高親和力和高特異性的適配子，用人FcγRI特異性核酸適配子建立初步的、應用于膿毒血癥實驗診斷的新方法。
　　方法:
　　1.體外化學合

2、成96 nt隨機ss DNA核酸文庫，文庫中核酸序列的兩端均為18 nt固定的引物序列，中間為60 nt的隨機序列，以重組人FcγRI蛋白片段為靶標，應用SELEX技術篩選針對人FcγRI高親和力和特異性的核酸適配子，用熒光標記法檢測ssDNA富集文庫與人FcγRI的結合力;
　　2.將第7、8輪篩選PCR產物TA克隆、測序，采用相關軟件對測序的單克隆核酸適配子進行生物信息學分析;
　　3.挑選人FcγRI單克隆核酸適配子，

3、使用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定其親和力、靈敏度和特異性。
　　結果:
　　1.熒光定量分析顯示，第6輪篩選ssDNA富集庫與人FcγRI結合力達到峰值，ssDNA富集庫與該靶標的結合位點達到飽和狀態(tài);
　　2.結合ClustalX1.83、Mega5和RNAstructure5.6分別將第7、8輪單克隆適配子分成7和5個家族;第7輪篩選的33條核酸適配子中有三對完全一致的富集序列;RNAstructure5.6模擬的核

4、酸適配子的二級結構主要以莖-環(huán)和G-四聚體結構為主;
　　3.流式細胞分析結合軟件計算適配子LW7-1、LW7-9與LW7-27的親和力分別為12.76 nM、14.03 nM、6.676 nM，Kd值均達到納摩爾水平，適配子檢測細胞數可低至2×106個;
　　4.流式細胞儀分析結果顯示，LW7-1、LW7-9和LW7-27與膿毒血癥中性粒細胞結合的熒光強度明顯比陰性對照和正常對照強，說明這三條適配子是針對中性粒細胞表面的F

5、cγRI蛋白的;
　　5.熒光顯微鏡分析顯示，三條適配子均能夠單獨或協(xié)同檢測膿毒血癥中性粒細胞，LW7-9所染細胞熒光強度最強，是我們后續(xù)研究的重點，熒光標記適配子直接檢測法(FLADA)也是我們建立的初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的新方法。
　　結論:
　　本研究運用SELEX技術經過8輪篩選，獲取針對人重組FcγRI胞外段蛋白特異性ssDNA核酸適配子，我們對部分核酸適配子進行了親和力、靈敏度