大鼠脊髓損傷后坐骨神經(jīng)電興奮性以及損傷脊髓GAP-43及VEGF蛋白表達(dá)的變化.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)對個人來說是一件災(zāi)難性的事件，可以引起患者脊髓損傷節(jié)段水平以下身體的感覺和運動功能的部分或全部喪失，而且還會給家庭和社會帶來一系列負(fù)面影響。近年來，大多數(shù)國家由于交通事故、暴力事件、意外情況等SCI的發(fā)病率居高不下，并有上升趨勢，然而對于SCI尚沒有特別有效的治療措施和方法。因此對SCI后脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的修復(fù)、再生及其功能恢復(fù)的進(jìn)一步研究具有非常重要的醫(yī)療價值和社會意義。

2、 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后對機(jī)體功能產(chǎn)生的影響和損害取決于脊髓原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷的程度，以及損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞自我修復(fù)和再生的能力。脊髓的原發(fā)性創(chuàng)傷迅速使細(xì)胞膜瓦解，破壞髓鞘、軸突及微管系統(tǒng)，從而釋放許多有害物質(zhì)引發(fā)更為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是由多種細(xì)胞和分子機(jī)制啟動的病理生理過程所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性變。這種神經(jīng)退行性變不僅局限在損傷部位，還擴(kuò)散到損傷周邊部位。由于原發(fā)性損傷的不可逆轉(zhuǎn)性，故目前醫(yī)

3、學(xué)研究和臨床治療修復(fù)損傷的方法主要是(1)針對脊髓創(chuàng)傷后繼發(fā)性損傷的細(xì)胞分子機(jī)制，如自由基生成、一氧化氮、血小板活化因子、興奮性氨基酸、離子紊亂、細(xì)胞炎性因子、脂質(zhì)過氧化物及細(xì)胞凋亡等尋求防治措施； (2)應(yīng)用神經(jīng)生長因子、生長相關(guān)蛋白和血管內(nèi)皮生長因子等，促進(jìn)損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和神經(jīng)軸突再生。 早在1944年，Berry應(yīng)用電生理方法研究了周圍神經(jīng)再生，隨后在1948年Hodes將此方法應(yīng)用于臨床，此后又發(fā)現(xiàn)刺激強(qiáng)度一時

4、間曲線、神經(jīng)傳導(dǎo)速度與周圍神經(jīng)損傷和再生的電生理變化規(guī)律。現(xiàn)在，電生理學(xué)方法已成為評價周圍神經(jīng)損傷結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的常用有效方法。 GAP-43(growth associated proteins-43，生長相關(guān)蛋白)是80年代初發(fā)現(xiàn)的與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關(guān)的一種快速轉(zhuǎn)運胞膜磷酸蛋白，被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個內(nèi)在決定因子。GAP-43蛋白及其mRNA廣泛分布于大腦、小腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)以及自主神經(jīng)系統(tǒng)的神

5、經(jīng)元內(nèi)，在發(fā)育中的神經(jīng)元沿著整個軸突表達(dá)，在生長錐表達(dá)尤其豐富。研究發(fā)現(xiàn)GAP-43能夠通過促進(jìn)肌動蛋白聚集，增強(qiáng)生長錐的活力，從而促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長、分化、再生及突觸重建。還發(fā)現(xiàn)GAP-43蛋白能使神經(jīng)在缺乏外源性營養(yǎng)因子的情況下長出新突起，同時增強(qiáng)神經(jīng)可塑性、突觸重構(gòu)和遞質(zhì)釋放。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)上、下通路的整合功能也是必需的。 目前，脊髓損傷的結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)是醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點。本實驗室以往的工作

6、已經(jīng)研究了SCI神經(jīng)細(xì)胞的病理變化，以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，然而關(guān)于SCI后損傷脊髓的神經(jīng)修復(fù)和再生機(jī)制仍是未解決的關(guān)鍵問題。鑒于GAP-43和VEGF是重要的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，并且能促進(jìn)神經(jīng)軸突生長和再生，而且VEGF還可以改善中樞神經(jīng)生長的微環(huán)境以及保護(hù)神經(jīng)元減少凋亡，所以對SCI后它們在損傷脊髓的表達(dá)時間、分布以及內(nèi)在神經(jīng)和血管修復(fù)的作用和機(jī)制的進(jìn)一步研究具有特殊的重要意義。因此，本實驗在大鼠急性脊髓損傷實驗動物模型上，應(yīng)用

7、電生理技術(shù)、GAP-43和VEGF免疫組織化學(xué)的方法，研究大鼠脊髓損傷后不同時間點大鼠坐骨神經(jīng)電興奮性，GAP-43與VEGF蛋白在損傷脊髓表達(dá)的變化，初步探討了GAP-43和VEGF在損傷脊髓中的作用及其可能機(jī)制。主要研究內(nèi)容： 1．大鼠SCI后不同時間點坐骨神經(jīng)電興奮性的改變?yōu)檠芯看笫骃CI后其功能的變化，本實驗觀察了正常大鼠、SCI后不同時間點最大刺激引起坐骨神經(jīng)動作電位振幅、興奮閾值和動作電位傳導(dǎo)速度的變化。結(jié)果為： (

8、1)大鼠SCI后不同時間點離體坐骨神經(jīng)最大動作電位振幅的變化：正常對照組最大刺激產(chǎn)生動作電位振幅的平均值為4.18±0.21mV，而在SCI后1d，3d，5d、7d和14d，動作電位幅值分別為1.22±0.15、3.69±0.27 mV、2.59±0.27mV、1.82±0.17 mV和0.52+0.10mV和1.22±0.15 mV。從中觀察到SCI后隨著時間的進(jìn)行，坐骨神經(jīng)動作電位幅度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，以第7d為最低，第14d有明

9、顯升高。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明大鼠SCI后各時間點坐骨神經(jīng)動作電位幅度與正常對照組存在顯著性差異(P<0.01)，各SCI組之間也存在顯著性差異(P<0.01)。 (2)大鼠SCI后不同時間點離體坐骨神經(jīng)興奮閾值的變化：正常對照組大鼠離體坐骨神經(jīng)干興奮性最高，其產(chǎn)生動作電位的興奮閾值為0.296±0.00 V；大鼠SCI后1d、3d、5d、7d和14d，興奮閾值分別為0.302+0.011 V、0.314±0.017 v、0.374±0.028

10、 V、0.596+0.045 v和0.386+0.033V，從中看到隨大鼠SCI后時間的推移，其興奮閾值呈時間依賴性升高，其中以SCI后第7d為最高。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理發(fā)現(xiàn)SCI后3d、5d、7d和第14d，坐骨神經(jīng)興奮閾值均明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.01)。 (3)大鼠SCI)舌不同時間點離體坐骨神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度的變化：正常對照組大鼠坐骨神經(jīng)干動作電位傳導(dǎo)速度為20.60±1.55rn/s：SCI后1d，3d，5d，7d和

11、14d傳導(dǎo)速度均低于對照組，分別為18.42±1.74 m/s、16.80±1.55 m/s、14.47±1.40 m/s、12.21±1.20 m/s和16.02+1.72m/s，其中以第7d為最低，第14d傳導(dǎo)速度有所回升。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理大鼠SCI后上述各時間動作電位傳導(dǎo)速度均較對照組存在非常顯著性差異(P<0.01)。以上結(jié)果表明大鼠SCI后離體坐骨神經(jīng)的興奮性和傳導(dǎo)性均呈時間依賴性降低，利用這些客觀的電生理指標(biāo)可以部分的反映損傷脊

12、髓的功能變化。 2.大鼠SCI后損傷脊髓GAP-43蛋白表達(dá)的變化研究表明GAP-43是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個內(nèi)在決定因子，其在損傷脊髓的表達(dá)量直接關(guān)系到損傷脊髓內(nèi)在結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的能力。本實驗用GAP-43的免疫組織化學(xué)的方法觀察了大鼠SCI后不同時間損傷脊髓中GAP.43表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：大鼠正常脊髓神經(jīng)元胞漿和軸突內(nèi)有少量GAP-43蛋白顆粒出現(xiàn)，呈淺褐色，GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)為2.53±0.77個。當(dāng)大鼠SCI后

13、神經(jīng)元胞體和軸突內(nèi)GAP-43蛋白表達(dá)顆粒明顯增加，染色強(qiáng)度增加。SCI后1d、3d、5d和7d時損傷脊髓周圍區(qū)GAP-43陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸遞增，分別為7.44±1.29個、10.71±2.17個、13.50±2.20個、16.33±2.96個和9.47±1.83個，其中以第7d GAP-43蛋白表達(dá)量最高。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示大鼠SCI后各時間點GAP-43陽性神經(jīng)元數(shù)量均較對照組存在非常顯著性差異(P<0.01)。另外，還發(fā)現(xiàn)在大鼠SC

14、I后的第7d、14d時，表達(dá)GAP-43的神經(jīng)元，其胞體直徑和軸突長度均較未表達(dá)GAP-43的神經(jīng)元大而長。結(jié)果表明大鼠SCI后早、中期，損傷脊髓周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)GAP-43蛋白呈時間依賴性的增加，提示內(nèi)源性修復(fù)性機(jī)制的存在。 3.大鼠SCI后損傷脊髓VEGF蛋白表達(dá)的變化VEGF具有促進(jìn)損傷脊髓血管新生和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)再生的作用。本實驗利用免疫組織化學(xué)方法觀察了大鼠SCI后不同時間點損傷脊髓周圍區(qū)VEGF蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果

15、發(fā)現(xiàn)對照組脊髓結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分布均勻，VEGF表達(dá)極少；而在SCI后1d，3d和7d損傷脊髓周圍區(qū)大運動神經(jīng)元細(xì)胞核和胞漿內(nèi)均出現(xiàn)較強(qiáng)的VEGF蛋白表達(dá)，第3d表達(dá)量最多為20.80±6.06個，與對照組0.60±0.89個比較，存在顯著性差異：SCI后第14d和28d時VEGF只出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)，其陽性神經(jīng)元數(shù)量為7.80±2.17個和2.60±1.82個，較SCI第7d時明顯下降，但仍較對照組顯著升高。在SCI后第3d損傷脊髓周圍區(qū)的

16、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)VEGF的表達(dá)，陽性神經(jīng)元的數(shù)量為13.25±3.16個；14d時達(dá)高峰，為35.83±6.11個；28d時陽性神經(jīng)元的數(shù)目較前減少，為21.50±4.93個；SCI各組VEGF陽性細(xì)胞數(shù)均較對照組差異非常顯著差異(P<0.01)。本實驗中VEGF在損傷脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的變化是，在SCI后第1d損傷脊髓周圍區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)呈強(qiáng)陽性，在隨后的第3d、7d、14d仍有表達(dá)，而在第28d時未見表達(dá)。以上結(jié)果

17、提示這種VEGF蛋白在大鼠SCI早、中期損傷脊髓的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)和血管高表達(dá)，關(guān)于其參與損傷脊髓內(nèi)源性神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，以及血管新生的作用及其機(jī)制有待于深入研究。總之，本實驗研究結(jié)果主要通過紀(jì)錄外周坐骨神經(jīng)電興奮性變化，為反映SCI后損傷脊髓功能改變提供了客觀而可靠的指標(biāo)，并初步證明了SCI后不同時間點損傷脊髓內(nèi)源性神經(jīng)及血管結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)蛋白GAP-43和VEGF的表達(dá)和分布，這對于進(jìn)一步了解SCI后其損傷脊髓組織的病理分子機(jī)制，