基于雜交瘤細(xì)胞單鏈抗體制備技術(shù)的應(yīng)用-抗GPV-NS1和GoIFN-γ單鏈抗體的構(gòu)建.pdf

1、單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)是通過基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因通過肽連接物首尾拼接而成的重組蛋白，它是具有抗原結(jié)合活性的最小抗體片段，其具有分子量小，對相應(yīng)抗原具有較強(qiáng)的親和力和特異性，能通過基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。此外，相對于單克隆抗體，單鏈抗體具有易保存的優(yōu)勢。單鏈抗體制備的關(guān)鍵是可變區(qū)基因的獲得，最常用的方法是從分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞

2、中擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，然后進(jìn)行拼接獲得單鏈抗體基因。本研究嘗試對實(shí)驗(yàn)室制備和保存的兩株單克隆抗體進(jìn)行單鏈抗體的構(gòu)建。
　　 首先從分泌抗鵝細(xì)小病毒NS1蛋白單克隆抗體和抗鵝IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，采用OligodT為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈，然后通過重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)PCR引物，擴(kuò)增出抗體可變區(qū)基因片段，并將VH和VL基因克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行測序。其次通過重疊延伸拼接法，

3、在VH下游和VL上游間引入連接肽編碼序列(Gly4Ser)3，分別拼接成GPV-NS1-ScFv基因和GoIFN-γ-ScFv基因，序列分析后將ScFv基因分別重組進(jìn)原核表達(dá)載體pET-32a和pET-30a-EAP中，鑒定后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌Rosetta(DE3)pLysS中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)的重組融合蛋白大小為46Ku和80Ku左右；抽提包涵體蛋白，經(jīng)純化得到較純的目的蛋白，通過

4、PBS梯度透析法對GPV-NS1-ScFv蛋白和Tris-Hcl梯度透析法對GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白進(jìn)行復(fù)性，并且分別采用間接ELISA法對GPV-NS1-ScFv的抗原性和直接ELISA法對GoIFN-γ-ScFv的抗原性進(jìn)行分析。
　　 本研究成功地?cái)U(kuò)增出兩種單抗的可變區(qū)基因，其中GPV-NS1蛋白單抗VL基因片段324bp，VH基因片段354bp；GoIFN-γ單抗VL基因片段342bp，VH基因片段357bp