廣西沼澤型水牛γ-干擾素基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、干擾素(IFN)是由干擾素誘生劑誘導(dǎo)生物細(xì)胞后所產(chǎn)生的一類高活性多功能的糖蛋白。干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型，γ-干擾素(IFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素，是由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的，具有廣譜抗病毒作用，也具有上調(diào)主要組織相溶性復(fù)合物Ⅱ(majorhistocompatibilitycomplexⅡ，MHCⅡ)類抗原分子的表達(dá)等作用，是影響機(jī)體細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的一類具有多種調(diào)節(jié)效應(yīng)的細(xì)胞因子。 本實(shí)驗(yàn)從健康沼澤型水牛靜脈無菌采血，分離外周血

2、單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用刀豆素A(ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)培養(yǎng)13、17h后，提取細(xì)胞總RNA，用水牛IFN-γ基因特異性引物通過RT-PCR擴(kuò)增了水牛IFN-γ的完全編碼區(qū)cDNA序列和成熟肽編碼區(qū)cDNA序列，將其克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)序列分析表明，水牛IFN-γ編碼區(qū)cDNA共有501bp，其序列與GenBank上報(bào)道的印度水牛IFN-γ核苷酸序列同源性高達(dá)99.6﹪，與牛、羊、豬、狗、馬、人和鼠的同源

3、性分別為97.8﹪、96.0﹪、85.8﹪、82.4﹪、81.0﹪、75.0﹪和60.7﹪。氨基酸序列與印度水牛同源性100﹪，與牛、羊、豬、狗、馬、人和鼠的同源性分別為97.6﹪、95.2﹪、77.1﹪、77.1﹪、76.5﹪、60.8﹪和40.6﹪。 將IFN-γ成熟肽編碼區(qū)基因亞克隆到表達(dá)載體pET-32a+中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-mIFN-γ，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21，于37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)7