聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的實驗研究.pdf

1、顱頜面部骨缺損是臨床上常見損傷,也是骨科臨床治療的難題之一。近年來,骨組織工程發(fā)展迅速,利用骨組織工程治療骨缺損成為研究的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protelns,BMPs)對骨原細(xì)胞的分化起決定性作用,是促進(jìn)成骨的重要因子之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular EndothelialGrowth Factor,VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原,可促進(jìn)新生血管形成。VEGF和BMPs的

2、表達(dá)相互促進(jìn),并在骨再生過程中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。構(gòu)建BMPs和VEGF雙基因修飾的組織工程骨,是促進(jìn)骨缺損修復(fù)的一種有效方法。
　　 目的:
　　 (1)探討聯(lián)合基因體外轉(zhuǎn)染BMSCs修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的可行性。(2)探討B(tài)MP2和VEGF165二者在修復(fù)顱骨缺損中的協(xié)同作用。(3)比較BMP2和VEGF165單基因轉(zhuǎn)染及聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM

3、SCs)修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的差異。
　　 方法:
　　 (1)取羊骨髓,體外分離、擴增培養(yǎng)BMSCs,并應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 (2)采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BMSCs,按照BMP2和VEGF165聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、BMP2單基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、VEGF165單基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空質(zhì)粒pIRES、。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分成五組,轉(zhuǎn)染后RT—PCR檢測各組BMSCs的BMP2、VEGF165基因的mRNA表達(dá)狀況,Wester

4、n-blot檢測各組BMSCs的BMP2和VEGF165蛋白表達(dá)水平。
　　 (3)將轉(zhuǎn)染后的各組BMSCs細(xì)胞接種到β-磷酸三鈣(β—TCP)支架材料上,接種后第7天行環(huán)境掃描電鏡觀察,Hoechst比色法檢測BMSCs在β—TCP支架材料上的增殖能力。
　　 (4).制作羊顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型,按分組將細(xì)胞支架復(fù)合物植入到顱骨缺損處,植入后12周、24周通過形態(tài)學(xué)觀察、CT檢查、組織學(xué)檢查的方法檢測顱骨缺損修復(fù)重建的效

5、果。
　　 結(jié)果:
　　 (1)經(jīng)Western-blot和RT—PCR檢測,外源性VEGF165及BMP2通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)可成功轉(zhuǎn)染BMSCs并表達(dá)相應(yīng)的mRNA及相關(guān)蛋白。
　　 (2)細(xì)胞接種到支架材料后7天,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在支架材料上生長增殖良好。Hoechst檢測表明接種后14天內(nèi)各組細(xì)胞生長曲線無明顯差異。
　　 (3)應(yīng)用自體BMSCs復(fù)合B—TCP修復(fù)羊顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,術(shù)后動物無

6、明顯不良反應(yīng),所有動物術(shù)后均存活,無感染發(fā)生.
　　 (4)植入后24周大體形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和影像學(xué)檢查表明,聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組和單用BMP2組有異位骨形成,聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組成骨面積多于單用BMP2組,其他各組均無成骨。
　　 結(jié)論:
　　 (1)聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染BMSCs可修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,其成骨效果優(yōu)于單用BMP2基因,而單用VEGFl65基因不能誘導(dǎo)細(xì)胞支架復(fù)合物的體內(nèi)成骨。
　　 (2)真核細(xì)胞表達(dá)載體(p

7、IRES-BMP2一VEGF165、pIRES—BMP2、pIRES—VEGF165)轉(zhuǎn)染使BMSCs中外源性BMP2、VEGF165得到表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)顱骨缺損的修復(fù)。
　　 (3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染BMSCs,細(xì)胞毒性低,不影響其在支架材料上的增殖和成骨分化。
　　 (4)通過重組質(zhì)粒體外經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞促進(jìn)組織工程骨形成的研究,初步實現(xiàn)了從體外研究向體內(nèi)研究的深入,并進(jìn)一步闡明在新骨生