兔傳代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的篩選及其成骨能力的研究.pdf

1、目的：1.本研究從兔骨髓液中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),進(jìn)行體外培養(yǎng),旨在建立一套行之有效的體外分離,培養(yǎng)BMSCs的方法。2.通過各代觀察BMSCs的形態(tài),檢測(cè)不同代BMSCs的細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞生長(zhǎng)周期,從而了解各代BMSCs的生物學(xué)性狀以及初步確定作為理想的組織工程種子細(xì)胞的理想代數(shù)。3.BMSCs在成骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞特定分化,通過檢測(cè)成骨細(xì)胞特有指標(biāo)Ⅰ型膠原,堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)的表達(dá),了解BMSCs向成骨細(xì)胞方

2、向分化的能力。
　　方法：1.利用骨穿針在兔股骨抽取骨髓液,利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁細(xì)胞篩選法對(duì)BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。2.觀察各代細(xì)胞形態(tài)并且測(cè)定各代細(xì)胞的增殖周期和細(xì)胞生長(zhǎng)周期,了解各代細(xì)胞的生物學(xué)性狀。3.在體外利用成骨誘導(dǎo)液(完全培養(yǎng)基中加入地塞米松濃度為10-8mol/L、β-磷酸甘油鈉10mmol/L、維生素C50ug/ml),在誘導(dǎo)的第7天,第14天和第21天分別檢測(cè)Ⅰ型膠原,堿性磷酸酶(ALP

3、),鈣結(jié)節(jié)表達(dá)。研究BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。
　　結(jié)果：1.利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法分離出了大量具有活性的BMSCs。接種48小時(shí)后觀察,見少量細(xì)胞呈長(zhǎng)梭性,大部分為短梭形和多邊形。接種72小時(shí)觀察,貼壁細(xì)胞明顯增多,呈長(zhǎng)梭形。接種第5天,細(xì)胞增殖明顯,并且可見若干細(xì)胞團(tuán)落形成。接種第7天,達(dá)到融合。2.第1,5,10代細(xì)胞經(jīng)MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè),第1代和第5代的增殖能力和生長(zhǎng)周期無顯著性差異(P>0.05),第

4、10代細(xì)胞與第1代細(xì)胞,第5代細(xì)胞之間的增殖能力和細(xì)胞生長(zhǎng)周期較前兩代有明顯的差別(P<0.05)。3.BMSCs向成骨方向分化:貼壁細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng),由最初的長(zhǎng)梭狀,逐漸向多角形發(fā)展。誘導(dǎo)組細(xì)胞呈現(xiàn)接觸性抑制,正常組呈現(xiàn)重疊性生長(zhǎng)。Ⅰ型膠原染色顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色,正常組胞質(zhì)未染色。ALP酶標(biāo)法顯示誘導(dǎo)組較正常組的含量明顯增加(P<0.05)。誘導(dǎo)組鈣結(jié)節(jié)染色呈紅色,正常組未染色。顯示BMSCs在特定條件下可以很好的向成骨細(xì)

5、胞分化。
　　結(jié)論：1.通過利用密度梯度離心法聯(lián)合貼別篩選法可以獲得較高純度和活性的BMSCs。2.通過對(duì)各代BMSCs形態(tài)學(xué)的觀查,細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞生長(zhǎng)周期的檢測(cè),證實(shí)第1,5代細(xì)胞之間的生物學(xué)特性無明顯的區(qū)別,第10代細(xì)胞增值減慢,處于非分裂期的細(xì)胞明顯增多,與第1,5代細(xì)胞之間有明顯的差別,且第5細(xì)胞已成為單一細(xì)胞系,所以確立第5代細(xì)胞可以成為組織工程中提供良好的種子細(xì)胞。3.通過利用成骨誘導(dǎo)液對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo),