bFGF基因轉染兔骨髓間充質干細胞同珊瑚骨體外復合培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、本文研究目的：采用骨組織工程技術，以骨髓間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)為種子細胞，轉染bFGF基因后，觀察bFGF對體外培養(yǎng)的骨髓基質干細胞增殖分化的影響；轉染bFGF基因的骨髓間充質干細胞，以珊瑚人工骨為支架進行體外復合培養(yǎng)，觀察支架的細胞相容性，為進一步的體內實驗奠定基礎。 研究材料與方法： 1.MSCs的獲取及純化培養(yǎng)：穿刺抽取新西蘭大白兔脛骨骨髓，采用密度梯度離心法分離MSCs

2、，再采用貼壁篩選法對分離出的MSCs進行純化。 2.MSCs成骨誘導培養(yǎng)：對獲得的部分MSCs用礦化誘導液誘導培養(yǎng)20天，進行Vonkossa染色。 3.bFGF-pcDNA3重組表達質粒的提?。篋H-5α菌(含牛bFGF-pcDNA3真核表達載體)擴增，用UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒抽提質粒，并對所得質粒酶切鑒定。 4.bFGF-pcDNA3轉染MSCs：利用脂質體轉染bFGF-pcDNA3到MSCs，

3、G418篩選獲得抗性克隆。培養(yǎng)擴增后進行免疫組化和western-blot檢測鑒定表達產物。 5.轉染細胞增殖特性檢測：利用MTT法檢測轉染細胞的增殖活力，并繪制生長曲線：利用流式細胞儀檢測轉染細胞的增值周期。 6.轉染細胞同珊瑚人工骨的復合培養(yǎng)：將轉染細胞制成細胞懸液，滴加至珊瑚表面復合培養(yǎng)，電鏡觀察珊瑚骨表面細胞的生長情況；利用MTT法檢測復合培養(yǎng)情況下轉染細胞的增殖活力。 研究結果： 1.獲得大量形

4、態(tài)均一的MSCs，部分細胞經成骨誘導培養(yǎng)后，Vonkossa染色可見黑色結節(jié)。 2.獲得bFGF-pcDNA3重組表達質粒，經酶切鑒定，重組質粒含有bFGF目的基因片斷。 3.脂質體介導bFGF-pcDNA3重組表達質粒轉染MSCs，獲得G418抗性克隆，經免疫組化和western-blot檢測，證實轉染細胞確實表達bFGF，并且表達部位在胞漿。 4.轉染細胞增值活力加強，生長曲線上移，處于增殖周期的細胞比例加大

5、。 5.掃描電鏡觀察轉染細胞在珊瑚支架上生長良好，MTT檢測表明轉染細胞在珊瑚支架生長未受到抑制。 研究結論： 1.通過密度梯度離心和貼壁篩選相結合的方法可以成功分離獲得MSCs。 2.用脂質體轉染法能將bFGF-pcDNA3重組真核表達載體成功導入體外培養(yǎng)的MSCs，篩選得到穩(wěn)定表達bFGF的MSCs，自身表達的bFGF可以促進MSCs增殖。 3.珊瑚人工骨具有良好的細胞相容性，具有廣闊的應用前