適配體的Post-SELEX篩選評價、表征及傳感新方法研究.pdf

1、寡核苷酸適配體（簡稱適配體，aptamer），系指經(jīng)指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選得到的一段短的單鏈寡核苷酸序列（ssDNA或RNA）。適配體通過折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)空間構(gòu)型互補(bǔ)與靶分子形成高親和力，高特異性結(jié)合，故又稱為“化學(xué)抗體”。其與靶分子之間的分子識別作用與抗體極為相似，但特異性和親和力甚至更高。與抗體相比，適配體穩(wěn)定性好、能夠進(jìn)行大量的化學(xué)合成、并且無免疫原性、無毒性。另外，適配體具有核酸自身變性復(fù)性快速可逆、

2、易功能化修飾與標(biāo)記、及作為優(yōu)良的納米器件等諸多特點(diǎn)，是一類重要的“明星分子”。
　　隨著新型SELEX篩選技術(shù)、高通量測序、生物芯片等序列活性評價技術(shù)的快速應(yīng)用，所篩選出來的適配體分子種類逐年增多，作用的靶分子范圍從離子、小分子、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白（酶），到細(xì)胞、組織、細(xì)菌、病毒等等，也更加廣泛。適配體在分析傳感、臨床診斷和治療方面存在巨大潛力。然而，到目前為止，僅有少量適配體進(jìn)入到臨床試驗(yàn)研究階段，僅有一種適配體藥物經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市

3、，即治療老年相關(guān)性黃斑病變的哌加他尼。做為商業(yè)化臨床診斷元件的適配體亦寥寥無幾，此點(diǎn)與蓬勃發(fā)展的適配體研究趨勢并不匹配。其主要技術(shù)瓶頸應(yīng)在于其自身二三級結(jié)構(gòu)不清、與藥靶的相互作用機(jī)制不明、體內(nèi)生物利用度尚待提高等方面。
　　從分子相互作用基礎(chǔ)層面而言，大多數(shù)適配體存在結(jié)構(gòu)上的易變性、多樣性，在與靶分子發(fā)生特異性的親和識別時，多以“自適應(yīng)”形成優(yōu)勢構(gòu)型，但大多數(shù)適配體—靶分子的精確結(jié)構(gòu)模型尚未得到，多數(shù)識別模式的判別具有片面性、經(jīng)驗(yàn)

4、性。另外，經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到的適配體全長序列中，僅有部分序列存在親和活性，亟需發(fā)展有效的技術(shù)方法指導(dǎo)結(jié)構(gòu)剪裁及修飾，從中尋找親和性更高、特異性更強(qiáng)、序列更短的適配體，除去冗余序列，提高適配體識別研究的容錯度、通用性和穩(wěn)定性。這就使得SELEX后優(yōu)化（Post-SELEX）成為研究“熱點(diǎn)”。Post-SELEX中多采用試錯法，依據(jù)核酸二級結(jié)構(gòu)及自由能（ΔG）的經(jīng)驗(yàn)性判斷，對適配體序列進(jìn)行較為隨機(jī)的剪裁或定點(diǎn)突變。其主要缺點(diǎn)在于隨機(jī)方

5、法效率較低、難度較大，尚無系統(tǒng)的理論指導(dǎo)和較好的解決方案。
　　本學(xué)位論文的主要內(nèi)容則針對上述post-SELEX中的基礎(chǔ)科學(xué)問題進(jìn)行了深入研究，共分為五章。
　　第一章為前言（文獻(xiàn)綜述）部分，概述了適配體的特點(diǎn)、應(yīng)用前景以及適配體研究存在的主要問題；對適配體后篩選優(yōu)化途徑、以及相應(yīng)的相互作用評價優(yōu)化方法進(jìn)行了總結(jié)和評述；以及對適配體結(jié)構(gòu)表征方法、適配體做為分析傳感元件的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。最后提出本論文的立題依據(jù)及主要的研

6、究內(nèi)容。
　　第二章為一種步進(jìn)型組合文庫的構(gòu)建及基于SPR的親和評價優(yōu)化方法研究。在本章中，我們基于組合化學(xué)思想，以重組人促紅細(xì)胞生成素α（EPO-α）的適配體807-39nt為模式分子，發(fā)明設(shè)計(jì)了四組步進(jìn)型序列，構(gòu)成新型的多方向、步進(jìn)型適配體小型組合文庫。該文庫包含向左收縮、向右收縮、兩端收縮和兩端擴(kuò)展等四組分子群，共35條序列。并開發(fā)了免標(biāo)記SPR方法，對上述適配體序列進(jìn)行快速、高效的篩選評價。最終得到了最短適配體—In27，

7、僅保留了初始適配體39nt二級結(jié)構(gòu)中的環(huán)部部分，但親和活性與之相當(dāng)。從而證實(shí)了該小型步進(jìn)型組合文庫構(gòu)建的合理性和高效性。
　　第三章為最短適配體In27的簡并序列及結(jié)合位點(diǎn)研究。本章使用定點(diǎn)堿基突變的方法，結(jié)合結(jié)構(gòu)域劃分，篩選評價得到In27序列中對結(jié)合產(chǎn)生較大影響的關(guān)鍵堿基。考慮到In27仍然保留了適配體39nt中富含連續(xù)鳥嘌呤核苷酸的序列，符合G四聚體（GQ）形成的一般原則，我們在圓二色譜（CD）表征的基礎(chǔ)上，將In27上的堿

8、基按-GG(G)-骨架為間隔，劃分為D1~D5個結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建了各定點(diǎn)突變分子群，共6組，分別命名為D1、D2、D3&4、D5、GQ和簡并序列定點(diǎn)突變分子群，共32條序列。我們使用表面等離子共振（SPR）方法篩選評價，從該定點(diǎn)突變分子群中最終得到In27的簡并序列，從而明晰了最短適配體In27的關(guān)鍵作用堿基。進(jìn)一步，我們采用親和競爭作用分析，界定了多種親和識別分子，如適配體39nt及In27、EPO受體（EPOR）、EPO的單克隆抗體以

9、及麥胚凝集素（WGA），在EPO-α上的結(jié)合作用模式。上述研究即為適配體的結(jié)構(gòu)作用特點(diǎn)研究及適配體做為分析傳感元件的成功應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　第四章為多種光譜技術(shù)對于適配體In27的活性高級結(jié)構(gòu)特征研究。適配體的結(jié)構(gòu)具有多樣性，其“自適應(yīng)”式優(yōu)勢構(gòu)型較易受到包括pH、陽離子類型、穩(wěn)定保護(hù)劑、甚至界面等在內(nèi)的微環(huán)境的影響與調(diào)控，這也是大多數(shù)適配體和靶分子間相互作用特點(diǎn)尚待厘清和闡明的主要原因之一。本章發(fā)展和使用SPR、CD及熒光探針

10、等多種光譜技術(shù)，研究和明確了In27的活性與構(gòu)型間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)陽離子Na+的存在和濃度是影響In27產(chǎn)生特異性親和識別的關(guān)鍵因素；Na+誘導(dǎo)下In27形成了平行/反平行的混合GQ構(gòu)型；兩種GQ熒光探針硫磺素T（ThT）和 N-甲基間卟啉IX（NMM）在該體系中可用做一對特征性的熒光探針，均可用于表征In27的活性高級構(gòu)型。EPO-α的加入可與ThT和NMM形成競爭，從而便于利用這兩種GQ熒光探針創(chuàng)建活性EPO-α的“光開關(guān)”型檢測方

11、法。上述研究為闡明新型適配體的活性構(gòu)型提供了有效的技術(shù)組合手段，亦為分析、傳感、診斷等應(yīng)用領(lǐng)域提供了一類作用特點(diǎn)清晰的適配體元件。
　　第五章為基于適配體的免標(biāo)記檢測方法研究。生物膜干涉技術(shù)（BLI）是一種新型的表面?zhèn)鞲屑夹g(shù)，具有免標(biāo)記、靈敏、快速、作用模式多樣等特點(diǎn)。本章中將生物素化的適配體39nt或In27固定于鏈霉親和素（SA）傳感芯片上，優(yōu)化了用于表面固定的適配體元件的取向、濃度、非特異性作用的克服、再生條件等因素，并利用

12、WGA和適配體作用于EPO-α的不同位點(diǎn)的特征，構(gòu)建信號放大傳感體系，用于溶液中EPO-α蛋白的靈敏檢測。同時比較了SPR和BLI技術(shù)方法的異同并闡述可能原因。本研究拓寬了適配體做為分析傳感元件的應(yīng)用范圍。
　　總之，本學(xué)位論文立意于創(chuàng)建創(chuàng)新性的小型多方向步進(jìn)型適配體組合文庫，從而高效地篩選優(yōu)化得到了最短適配體—In27，并在明確其關(guān)鍵堿基位點(diǎn)的貢獻(xiàn)基礎(chǔ)上構(gòu)建簡并序列。以多種光譜學(xué)技術(shù)手段，明確和簡化得到影響適配體活性構(gòu)型的關(guān)鍵溶