基于Cell-SELEX技術(shù)的轉(zhuǎn)移性大腸癌特異性核酸適配子的篩選鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、前言：
　　腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的重大疾病，侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤病人的主要死亡原因。大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，就診時50％以上的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率只有6％。因此，發(fā)展針對轉(zhuǎn)移性大腸癌的高效診斷和治療方法對提高患者生存率具有重要意義。然而，目前缺乏有效的技術(shù)和方法發(fā)現(xiàn)并檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物，制約了臨床診斷、治療的準(zhǔn)確性和有效性。
　　核酸適配子（aptamer）是一段短的寡核苷酸序列（ssDNA或R

2、NA），是利用指數(shù)富集的系統(tǒng)進化技術(shù)(the systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)從包含各種寡核苷酸序列的文庫中篩選得到。將隨機寡核苷酸文庫與靶分子孵育結(jié)合，經(jīng)過多輪的篩選和擴增，得到能與靶分子高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，即核酸適配子(aptamer)。核酸適配子可以折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，通過空間構(gòu)型互補與靶分子結(jié)合，與蛋白抗體相比具有以下

3、優(yōu)點:(1)親和性和特異性更高;(2)作用的靶分子范圍更廣;(3)穩(wěn)定性好，不易降解;(4)分子量小，組織滲透性強;(5)免疫原性和毒性低;(6)容易合成和易于修飾。因此，核酸適配子的篩選及其應(yīng)用研究在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注，為疾病的診斷和治療研究提供一種全新的手段。
　　在傳統(tǒng)SELEX技術(shù)基礎(chǔ)上，發(fā)展了以完整活細胞為靶標(biāo)的篩選技術(shù)即Cell-SELEX技術(shù)。與以單一純化靶蛋白為靶標(biāo)的傳統(tǒng)SELEX技術(shù)相比，Cell-SE

4、LEX技術(shù)具有的主要優(yōu)勢是:首先，篩選時以活體細胞為對象，使篩選所得的核酸適配子能夠識別處于活性狀態(tài)的生物分子;其次，可以在不需要了解細胞分子特征的情況下進行篩選;第三，一次篩選可獲得多個識別不同靶分子的核酸適配子。近年通過在篩選過程中引入消減策略，即將具有差異生物學(xué)行為的細胞配對進行消減篩選，使篩選到的核酸適配子具有更高的特異性，可以分辨出細胞亞型之間的微小差異?；贑ell-SELEX技術(shù)的諸多優(yōu)勢，近年，眾多研究者采用該技術(shù)獲得腫

5、瘤特異性核酸適配子，并應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤細胞的靶向成像、循環(huán)腫瘤細胞的捕獲富集以及藥物的的靶向遞送等。
　　由Cell-SELEX技術(shù)篩選得到的核酸適配子可與細胞表面靶分子特異結(jié)合，其中能與細胞表面受體結(jié)合的核酸適配子可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞，因而可以作為藥物載體實現(xiàn)藥物的靶向遞送。目前化療仍然是臨床腫瘤治療的主要手段之一，但存在的主要問題是缺乏靶向性和選擇性，對正常組織/細胞具有較強的毒副作用，而且在化療方案進

6、行的過程中，絕大部分患者很快發(fā)生獲得性耐藥，產(chǎn)生治療抵抗。而通過主動靶向遞送系統(tǒng)將化療藥物釋放至腫瘤組織/細胞，能夠顯著性地增加藥物的功效并降低其毒副作用。相對普遍使用的主動靶向載體如蛋白類抗體，核酸適配子具有更好的體內(nèi)應(yīng)用優(yōu)勢，如分子量小、組織滲透性強、免疫原性低等。目前已有研究將其作為靶向載體將化療藥物、siRNA、底物酶等靶向輸送至特定的器官、組織甚至細胞，有效提高了藥物在靶組織/細胞的濃度，并降低毒副作用。
　　核酸適配子

7、容易修飾和標(biāo)記的特點使其易于與各種納米材料結(jié)合形成分子探針進行靶向成像。量子點(QD)是尺寸介于1-20nm之間，通常是由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP、InAs等）元素組成的一種半導(dǎo)體熒光納米顆粒。與傳統(tǒng)的有機染料相比，量子點具有激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱，量子產(chǎn)率較高，熒光壽命長，光穩(wěn)定性好，抗光漂白能力強，發(fā)射光顏色與粒徑大小關(guān)聯(lián)等優(yōu)點，已廣泛的應(yīng)用于化學(xué)生物傳感與生物醫(yī)學(xué)成像等領(lǐng)

8、域，特別在腫瘤成像應(yīng)用研究中，多種熒光量子點已被發(fā)展成為腫瘤標(biāo)記物識別探針，實現(xiàn)了細胞以及活體層面腫瘤的特異性檢測以及靶向成像。隨著SELEX技術(shù)的不斷進步，越來越多腫瘤特異性的核酸適配子被篩選出來，并作為腫瘤靶向分子與量子點結(jié)合形成熒光探針，在腫瘤細胞靶向成像、檢測以及靶向治療研究中得到了重要應(yīng)用。
　　在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，脫離原發(fā)腫瘤、侵襲并進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞被稱為循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)。許多研究表明，對外周血中的循環(huán)腫

9、瘤細胞進行檢測分析，有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的微轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測和判斷、評估化療/放療治療效果、以及評估預(yù)后和監(jiān)測復(fù)發(fā)等。循環(huán)腫瘤細胞在血液中數(shù)量極少（尤其是早期腫瘤），檢測難度大，研究顯示，利用核酸適配子與靶細胞的高特異性、高親和力的結(jié)合特性，可實現(xiàn)對腫瘤患者循環(huán)腫瘤細胞的高效富集，用于進行腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及用藥療效的監(jiān)測。
　　為此，本研究采用消減Cell-SELEX技術(shù)，以轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系LoVo為靶細胞，非轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系

10、HCT-8為消減細胞進行消減篩選，獲得了一組7個與轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞特異性結(jié)合的核酸適配子。利用核酸適配子與靶細胞表面分子的不同結(jié)合特性，進行了不同的功能性應(yīng)用:能夠識別靶細胞表面受體的核酸適配子W14作為藥物載體，實現(xiàn)了抗腫瘤藥物阿霉素的靶向輸送;具有最高親和力的核酸適配子W3與量子點偶聯(lián)形成分子探針，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞/組織的靶向成像，同時還證實核酸適配子W3結(jié)合的靶分子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān);采用核酸適配子W3建立了基于磁珠和基于

11、微流控芯片的細胞捕獲系統(tǒng)，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的靶向捕獲和富集，為轉(zhuǎn)移性腫瘤的檢測、診斷和治療提供了新的方法和手段。
　　材料與方法：
　　一、轉(zhuǎn)移性大腸癌特異性核酸適配子的篩選及鑒定
　　1、構(gòu)建隨機寡核苷酸文庫，對文庫特性分析和PCR擴增條件進行優(yōu)化。以轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系LoVo為靶細胞，非轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系HCT-8為消減細胞進行消減Cell-SELEX篩選，利用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡監(jiān)測文庫的富集程度。

12、　　2、選取富集程度最高的文庫進行測序，并對序列進行結(jié)構(gòu)分析，選取候選適配子進行細胞結(jié)合鑒定，確定其特異性和親和力，以及不同溫度下的結(jié)合能力。
　　3、探討核酸適配子結(jié)合靶點的生化特性，分別使用胰蛋白酶和蛋白酶K處理細胞，流式細胞術(shù)檢測處理前后細胞與核酸適配子的結(jié)合能力。
　　4、將核酸適配子與不同組織來源的細胞系進行細胞選擇性分析(SW620、HCT116、 HT29、 CX1、CloneA、 CL187、SGC-7901

13、、BGC823、MDA-MB-231、MDA-MB-435、 MCF7、 H1229、 SMMC7721、U87MG、U251MG、HEK293、GES-1、CHO、NIH3T3等），流式細胞術(shù)檢測核酸適配子與各細胞系的結(jié)合能力。
　　二、核酸適配子W14-阿霉素(W14-Dox)靶向載藥系統(tǒng)的建立
　　1、流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡觀察分析核酸適配子W14結(jié)合受體并經(jīng)受體介導(dǎo)進入靶細胞內(nèi)。同時，利用瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞術(shù)考

14、察核酸適配子W14在含10％ FBS培養(yǎng)基和人新鮮血漿中的穩(wěn)定性。
　　2、制備W14-Dox復(fù)合物，熒光光譜分析并優(yōu)化阿霉素嵌入DNA中的比例，利用流式細胞術(shù)分析W14-Dox復(fù)合物與靶細胞的結(jié)合能力。
　　3、體外評估W14-Dox靶向體系的有效性，用W14、Dox和W14-Dox分別與靶細胞LoVo或非靶細胞HCT-8共孵育，利用熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)檢測不同形式Dox的細胞特異性攝取，MTS法檢測不同形式的Dox的靶

15、向殺傷活性。
　　三、核酸適配子-量子點探針(W3-QD)對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的靶向成像及多靶點應(yīng)用
　　1、W3-QD探針分別與細胞系LoVo、SGC-7901、MDA-MB-231、HeLa、CL187、HEK293孵育，熒光顯微鏡下觀察W3-QD探針對細胞系的靶向成像。
　　2、皮下和尾靜脈注射人胃癌高侵襲細胞系SGC-7901分別制備荷瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，取皮下移植瘤和肺組織轉(zhuǎn)移瘤常規(guī)包埋制備石蠟切片。
　　

16、3、W3-QD探針分別與裸鼠模型石蠟切片和臨床大腸癌病理切片孵育，考察其靶向成像的能力。
　　4、流式細胞術(shù)分選W3陽性細胞亞群，并分析其生物學(xué)行為:采用MTS法分析細胞的體外增殖能力，軟瓊脂形成實驗分析細胞的單克隆形成能力，劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗分析細胞的體外遷移能力和Transwell細胞侵襲實驗分析細胞的體外侵襲能力。
　　5、利用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡觀察分析各核酸適配子在結(jié)合靶細胞上是否存在相互干

17、擾，同時利用各核酸適配子結(jié)合不同的靶分子的特性，對多靶點結(jié)合檢測靶細胞進行了初步的考察。
　　四、核酸適配子W3對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的靶向捕獲富集
　　1、制備功能性磁性(W3-beads)，并考察W3-beads對靶細胞的特異性捕獲，同時探討其對不同混合比例下靶細胞的捕獲能力和捕獲效率。
　　2、將靶腫瘤細胞摻入全血中，流式細胞術(shù)檢測核酸適配子W3對全血中腫瘤細胞的識別能力，并考察W3-beads對全血中腫瘤細胞的捕獲能

18、力。
　　3、采用正光膠制備PDMS微流控芯片，并考察核酸適配子W3在芯片中捕獲細胞的條件優(yōu)化:核酸適配子W3的使用濃度和注入細胞時的流速。
　　4、考察核酸適配子W3在芯片中對混合細胞中靶細胞的靶向捕獲能力，以及不同混合細胞比例下的捕獲能力。
　　實驗結(jié)果：
　　一、轉(zhuǎn)移性大腸癌特異性核酸適配子的篩選及鑒定
　　本研究以轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系LoVo為靶細胞，非轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系HCT-8為消減細胞進行消減C

19、ell-SELEX，成功獲得7條能夠與靶細胞LoVo高親和力和特異性的核酸適配子（W1、W3、W6、W9、W14、W17和W22），其解離常數(shù)均在納摩爾級別。在不同溫度下（4℃、25℃和37℃）下，各核酸適配子均能與靶細胞高親和力的結(jié)合。酶處理實驗結(jié)果顯示，W1和W3與靶細胞的結(jié)合未被蛋白酶的作用所破壞，推測結(jié)合的靶分子是膜表面的非蛋白分子;而其他核酸適配子（W6、W9、W14、W17和W22）可被蛋白酶消化而破壞，推測結(jié)合的靶分子是細

20、胞膜表面蛋白;內(nèi)吞實驗結(jié)果顯示，W6、W9和W14結(jié)合的靶分子是膜表面受體并可經(jīng)受體介導(dǎo)進入靶細胞內(nèi)。此外，細胞結(jié)合實驗顯示7個核酸適配子與正常細胞均不結(jié)合，而除了與靶細胞LoVo高親和力結(jié)合之外，與其他轉(zhuǎn)移性大腸癌或不同組織來源的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞均有結(jié)合(SW620、HCT116、SGC7901、HeLa、C6等)，核酸適配子具有轉(zhuǎn)移性腫瘤的結(jié)合特異性。
　　二、核酸適配子W14-阿霉素(W14-Dox)靶向載藥系統(tǒng)的建立

21、　　受體結(jié)合的核酸適配子W14與Dox偶聯(lián)作為藥物載體，W14-Dox復(fù)合物的熒光檢測結(jié)果提示，當(dāng)W14與Dox的摩爾比為0.25時，Dox的自發(fā)熒光基本淬滅，提示一個核酸適配子W14分子中可以嵌入四個Dox分子形成復(fù)合物。細胞結(jié)合實驗顯示復(fù)合物保留了核酸適配子W14對靶細胞的特異性和親和力，并能夠被靶細胞選擇性地攝入。MTS檢測顯示W(wǎng)14-Dox復(fù)合物能夠特異性殺傷靶細胞，并降低了Dox對非靶細胞的殺傷作用。此外，核酸適配子W14在人

22、新鮮血漿中未被降解并保持其與靶細胞的結(jié)合能力，具有很好的生物穩(wěn)定性，提示核酸適配子W14可以作為體內(nèi)靶向用藥的載體。
　　三、核酸適配子結(jié)合量子點(W3-QD)對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的靶向成像及多靶點應(yīng)用
　　應(yīng)用制備的W3-QD探針分別探討其對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞系、荷瘤裸鼠腫瘤組織以及大腸癌患者腫瘤組織的靶向成像能力。熒光顯微鏡成像顯示，W3-QD探針不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞系的靶向成像，還能對荷瘤裸鼠模型和轉(zhuǎn)移模型以及臨床大腸

23、癌病理標(biāo)本的腫瘤組織靶向成像。對89例的臨床大腸癌標(biāo)本進行熒光信號的采集以及統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示W(wǎng)3-QD的熒光強度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否高度相關(guān)，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性腫瘤組織的熒光信號高于非轉(zhuǎn)移性腫瘤組織，提示核酸適配子W3結(jié)合的靶細胞表面分子可能為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物?；诖送茰y，采用流式分選技術(shù)對靶細胞LoVo進行了基于W3結(jié)合特異性的分選，收集得到LoVo W3+細胞亞群和LoVo W3-細胞亞群。兩個亞群細胞的生物學(xué)行為分析顯示LoVo

24、W3+細胞亞群的體外增殖能力和單克隆形成能力與LoVo W3-細胞亞群相似，但是體外的遷移和侵襲能力顯著高于LoVo W3-細胞亞群，進一步說明核酸適配子W3結(jié)合的靶分子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。核酸適配子的競爭實驗結(jié)果顯示，7個核酸適配子結(jié)合的細胞表面靶分子都是不同的，聯(lián)合使用對腫瘤細胞進行多靶點檢測時，可以提高檢測的靈敏度和檢出率。
　　四、核酸適配子W3對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的靶向捕獲富集
　　將核酸適配子W3結(jié)合磁珠(W3-b

25、eads)建立細胞捕獲系統(tǒng)，分析結(jié)果顯示，W3-beads能夠特異性的捕獲靶細胞，在不同比例的靶細胞/非靶細胞混合液中均能對靶細胞進行靶向捕獲。即使在靶細胞只占1％的低比例下，捕獲細胞仍能保持較高的純度。將靶細胞摻入全血中，W3-beads能夠保持其與靶細胞的結(jié)合力并能對靶細胞進行特異性的捕獲富集。
　　將核酸適配子W3固定于微流控芯片通道中建立基于微流控芯片的細胞捕獲系統(tǒng)，通過對核酸適配子W3的使用濃度和細胞注入時的流速進行優(yōu)化

26、，核酸適配子W3能夠在芯片通道內(nèi)特異性的捕獲靶細胞，在不同混合比例的細胞中也能保持對靶細胞的靶向捕獲，這為下一步對臨床腫瘤病人血液中循環(huán)腫瘤細胞的收集及檢測提供了很好的實驗基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1、通過消減Cell-SELEX技術(shù)，成功獲得了7個針對轉(zhuǎn)移性大腸癌LoVo細胞的高親和性核酸適配子;這些核酸適配子均不與正常細胞結(jié)合，與具有侵襲轉(zhuǎn)移傾向的不同組織來源的腫瘤細胞特異性結(jié)合，表現(xiàn)為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移特異性。
　　2

27、、以核酸適配子W14作為藥物載體，構(gòu)建W14-Dox靶向釋藥系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞LoVo的靶向殺傷作用，明顯降低了對非靶細胞的細胞毒性。
　　3、以核酸適配子W3制備量子點探針（W3-QD），實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞系、荷瘤裸鼠腫瘤組織和臨床大腸癌病理組織的靶向成像，并證實核酸適配子W3結(jié)合的靶分子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān);篩選得到的7個核酸適配子對靶細胞的識別無相互干擾，聯(lián)合應(yīng)用明顯提高成像靈敏度。
　　4、采用建立