雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、病毒性肝炎(virushepatitis)傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，流行范圍廣，是全球最主要的傳染病之一。病毒性肝炎肝損傷主要由免疫介導(dǎo)，在肝臟局部，肝細(xì)胞受HBV感染后激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥與化學(xué)趨化因子，將炎癥、淋巴細(xì)胞活化并募集至肝臟，這些炎癥和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)如果導(dǎo)致過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，則最終引起肝組織的損傷。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和抑制肝臟炎癥是乙型肝炎治療的重要策略之一。 雙環(huán)醇(6—甲氧羰基-6’—羥甲基-2，3，2’，3’—

2、二亞甲基二氧基-4，4’—二甲氧基聯(lián)苯)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所劉耕陶院士和張純貞教授合作的科研小組歷經(jīng)15年艱辛研制成功，該藥降低轉(zhuǎn)氨酶作用顯著，對(duì)肝細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，并具有抗肝纖維化的作用，長(zhǎng)期使用無(wú)明顯不良反應(yīng)。雙環(huán)醇的問世為病毒性肝炎的治療提供了一種新的安全、有效的輔助治療藥物，其藥理基礎(chǔ)和作用機(jī)制均值得繼續(xù)深入研究。迄今為止，已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，雙環(huán)醇對(duì)四氯化碳(CCl4)、D—氨基半乳糖、對(duì)乙酰氨基酚、脂多糖(LP

3、S)和刀豆蛋白A(ConA)等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝損傷均有保護(hù)作用，作用機(jī)制涉及抑制氧化和免疫損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞膜穩(wěn)定等。但尚缺乏雙環(huán)醇對(duì)病毒感染造成的肝臟炎癥的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究。 近年來(lái)關(guān)于病原體相關(guān)分子模式(Pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)的研究進(jìn)展表明，激活高等動(dòng)物天然免疫應(yīng)答的PAMPs廣泛存在于病原體細(xì)胞表面，識(shí)別PAMPs是以模式識(shí)別受體(Patternrec

4、ognitionreceptors，PPRs)，Toll樣受體(Toll—likereceptors，TLRs)介導(dǎo)的。細(xì)菌和病毒的DNA作為一種PAMPs能被機(jī)體識(shí)別并激發(fā)免疫應(yīng)答，是因?yàn)槠浠蚪M中的一段以非甲基化CpG二核苷酸為核心的高保守序列，即CpG基序(CpGmotif)。機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)TLR9(Toll—likereceptor9)特異識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序并形成受體復(fù)合物后，通過(guò)髓性分化因子88(myeloi

5、ddifferentiationfactor88，MyD88)依賴途徑，激活NF—κB(nuclearfactor—κB)通路和應(yīng)激酶通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞應(yīng)答和分泌炎癥因子，當(dāng)炎癥因子過(guò)度釋放時(shí)，則造成宿主的炎癥或損傷。研究證實(shí)人工合成的含一個(gè)或數(shù)個(gè)非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核酸(CpGoligodeoxynucleotides，CpG—ODNs)，也具有和細(xì)菌及病毒DNA中CpG基序一樣的免疫刺激效應(yīng)。因

6、此，CpG—ODNs可用以模擬細(xì)菌和病毒等微生物病原侵入機(jī)體所引發(fā)的免疫反應(yīng)狀態(tài)，構(gòu)建相應(yīng)的疾病模型。 目前已有研究小組構(gòu)建了CpG—DNA/LPS以及CpG—DNA/D—GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，為我們進(jìn)一步研究病毒感染后的肝臟炎癥免疫病理提供了可能的模型。本研究中，我們用CpG—ODN/D—GalN造成小鼠肝損傷，模擬小鼠感染DNA病毒后所引起的肝臟炎癥反應(yīng)，來(lái)研究雙環(huán)醇的保護(hù)作用和機(jī)制。根據(jù)CpG—ODN的免疫活性具有

7、種屬特異性的特征，第一部分研究中，我們以對(duì)小鼠具有最佳免疫效果的CpG1826構(gòu)建小鼠肝損傷模型；第二部分研究中，則以對(duì)人類最具免疫效應(yīng)的CpG2006模擬病毒刺激人正常細(xì)胞株L02細(xì)胞，從整體動(dòng)物和離體細(xì)胞兩個(gè)水平研究雙環(huán)醇對(duì)CpG—ODN造成的免疫性炎癥的保護(hù)作用，及其對(duì)TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路分子的活化和細(xì)胞因子分泌的作用。 方法：用不同濃度雙環(huán)醇(0.01，0.1，0.5mM)與L02細(xì)胞溫孵2小時(shí)后，加入濃度為10μg/

8、mlCpG—ODN2006，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)，模型組僅加入10μg/mlCpG—ODN2006。用ELIDA法測(cè)定培養(yǎng)上清中17NF—α、和IL-18及趨化因子MCP-1，RANTES和MIP-1α等水平；Westernblot法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)；Westernblot法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)p—NF—κBp65、p—p38—MAPK，pErk1/2-MAPK的變化。 結(jié)果：雙環(huán)醇能夠劑量依賴性地抑制CpG—ODN

9、誘導(dǎo)的L02細(xì)胞趨化因子的釋放和TNF—α等細(xì)胞因子的分泌，其中雙環(huán)醇0.5mM組和模型組相比，TNF—α、IL-18、MCP-1、MIP-1α和Rantes分別降低77.9％，88.7％，74.6％，63.3％和64.0％。Wersternblot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致表明，雙環(huán)醇0.5mM和0.1mM能夠下調(diào)L02細(xì)胞內(nèi)經(jīng)ODN誘導(dǎo)表達(dá)的TLR9，同時(shí)，還能抑制相關(guān)NF—κB通路蛋白p65和MAPK通路相關(guān)蛋白p38及ERK1/2的磷

10、酸化。 結(jié)論：雙環(huán)醇能明顯抑制CpG—ODN誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞株L02炎癥因子和趨化因子的釋放與分泌，并且抑制L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)及相關(guān)NF—κB和MAPK．信號(hào)傳導(dǎo)途徑分子的磷酸化活性。 綜上，本課題首次研究了雙環(huán)醇對(duì)CpG—ODN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，并從整體動(dòng)物水平和離體細(xì)胞水平研究了雙環(huán)醇對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明，雙環(huán)醇能顯著降低CpG—ODN誘導(dǎo)上升的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶并改善肝臟病理情況。其機(jī)制可能

11、與雙環(huán)醇既參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，又對(duì)肝細(xì)胞有直接的保護(hù)作用有關(guān)。雙環(huán)醇在體內(nèi)能抑制小鼠血清和肝組織中炎癥因子(TNF—α，IL-18，IFN—γ)和趨化因子MCP-1，MIP-1α，和RANTES的水平；同時(shí)也能直接抑制體外培養(yǎng)的L02細(xì)胞分泌這些因子。同時(shí)，雙環(huán)醇還能下調(diào)L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)及其信號(hào)途徑所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如NF—κB—p65，MAPK—p38和ERK1/2的活化。因此，雙環(huán)醇可以從多途徑減輕CpG—ODN對(duì)肝臟造