雙環(huán)醇對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷和肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、酒精性肝病(ALD)的發(fā)生、發(fā)展是涉及遺傳、營養(yǎng)和環(huán)境因素的多因素過程，其早期發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放、線粒體損傷、肝細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。已知ALD的早期損傷如經(jīng)及時(shí)治療多可逆轉(zhuǎn)，因此尋找治療ALD的藥物具有重要的臨床意義。 本研究選用兩種簡單、易行的急性酒精性肝損傷模型，模擬ALD早期損傷，觀察雙環(huán)醇的保護(hù)作用，并針對(duì)ALD早期致病因素探討雙環(huán)醇的相關(guān)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、1.雙環(huán)醇對(duì)急性酒精中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。 小鼠單次酒精(6g/kg)灌胃可導(dǎo)致急性肝損傷，表現(xiàn)為血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平升高至對(duì)照組的2.3倍、肝臟甘油三酯蓄積達(dá)3.6倍以及中央靜脈和小葉間靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹、水樣變性等病理變化。雙環(huán)醇預(yù)處理(200，300mg/kg)劑量依賴性顯著抑制血清ALT升高(分別降低60％和71％)和肝臟甘油三酯蓄積(分別降低18％和35％)，并明顯改善上述肝組織病理變化。

3、 氧化應(yīng)激是急性酒精性肝損傷的主要誘因之一。酒精灌胃后6h時(shí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應(yīng)性底物(TBARS)水平開始升高，12h時(shí)為對(duì)照組的2.7倍；而非酶抗氧化物谷胱甘肽(GSH)含量從1.5h即開始下降，6h時(shí)降至對(duì)照組的40％。雙環(huán)醇(300mg/kg)可顯著抑制TBARS水平的升高(32％)，并防止GSH耗竭，使其維持在正常水平。此外，酒精灌胃后1.5h時(shí)肝臟抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱

4、甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性發(fā)生顯著變化，與對(duì)照組相比分別降低35％、18％、49％、45％。雙環(huán)醇預(yù)處理(200，300mg/kg)可顯著抑制SOD和GSH-Px活性的降低，使SOD活性分別恢復(fù)至對(duì)照組的94％和99％，GSH-Px活性分別恢復(fù)至對(duì)照組1.3倍和1.5倍。雙環(huán)醇(300mg/kg)對(duì)CAT和GR活性的降低也有一定改善作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素

5、—1β(IL-1β)是介入ALD損傷的重要炎癥因子。酒精灌胃后1.5h肝臟TNF-α和IL-1β蛋白水平開始升高，12h達(dá)峰，分別為正常對(duì)照組的2.4倍和1.7倍。雙環(huán)醇(200，300mg/kg)可明顯抑制肝臟TNF-α和IL-1β水平升高，使TNF-α蛋白水平分別降低33％和47％，IL-1β蛋白水平分別降低26％和46％。酒精灌胃后12h，TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)分別增至對(duì)照組的2倍、2.4倍，而雙環(huán)醇可明顯抑制這一變化

6、。此外，雙環(huán)醇(300mg/kg)還可減少Kupffer細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。 內(nèi)毒素是激活Kupffer細(xì)胞的主要因素。酒精灌胃后1.5h血漿內(nèi)毒素含量顯著升高(達(dá)到對(duì)照組的9.6倍)，6h后可恢復(fù)至正常水平。雙環(huán)醇(200，300mg/kg)可顯著抑制血漿內(nèi)毒素含量升高，抑制率分別為79％、60％。CD14是內(nèi)毒素活化Kupffer細(xì)胞的關(guān)鍵受體。酒精灌胃后12h可誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞CD14的高表達(dá)。雙環(huán)醇(300mg/

7、kg)可顯著抑制CD14的過表達(dá)。 由此可見，雙環(huán)醇對(duì)急性酒精性肝損傷有顯著的保護(hù)作用，其肝保護(hù)機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞因子表達(dá)、降低血漿內(nèi)毒素水平和CD14表達(dá)以抑制Kupffer細(xì)胞活化相關(guān)。 2.雙環(huán)醇對(duì)酒精中毒小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究。 小鼠連續(xù)三次酒精(6g/kg)灌胃后可導(dǎo)致明顯肝損傷，變現(xiàn)為血清ALT水平升高(為對(duì)照組的2.2倍)，肝臟炎癥相關(guān)蛋白環(huán)氧合酶—2(COX—2)表達(dá)增

8、加(為對(duì)照組的2.2倍)，肝組織出現(xiàn)髓樣變性、小空泡變性和炎性細(xì)胞浸潤。酒精中毒小鼠還出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。雙環(huán)醇給藥可明顯降低酒精誘導(dǎo)的血清酶學(xué)改變，還可抑制COX—2蛋白的過表達(dá)，減輕肝臟病理改變，同時(shí)具有抑制肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 酒精在體內(nèi)的代謝過程中可生成毒性代謝產(chǎn)物—乙醛，同時(shí)伴隨產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，是后續(xù)氧化/硝化應(yīng)激的始

9、發(fā)因素。模型組參與乙醇代謝的胞漿乙醇脫氫酶(ADH)活性升高至對(duì)照組的1.5倍，微粒體細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)活性和蛋白表達(dá)也分別升高至對(duì)照組的2.2倍和2.6倍。雙環(huán)醇(300mg/kg)可使ADH和CYP2E1活性分別降低20％和25％，CYP2E1蛋白的過表達(dá)可基本恢復(fù)至正常水平。此外，模型組線粒體和胞漿乙醛脫氫酶(ALDH)活性分別升高27％和66％，雙環(huán)醇(300mg/kg)可顯著抑制胞漿ALDH活性的增加。

10、 酒精引起的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致模型組動(dòng)物肝臟氧化蛋白含量升高至對(duì)照組的1.7倍，胞漿NAD+/NADH則降低30％，而線粒體GSH含量降低10％。雙環(huán)醇給藥(200，300mg/kg)可顯著抑制酒精誘導(dǎo)的氧化蛋白含量升高，改善NAD+/NADH下降，并使GSH維持在正常水平。 除氧化應(yīng)激外，酒精還可誘發(fā)硝化應(yīng)激。酒精連續(xù)三次灌胃后，小鼠肝臟一氧化氮(NO)含量升高至對(duì)照組的1.5倍，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性和蛋白表達(dá)分

11、別升高至對(duì)照組的2.6和3.2倍，硝基酪氨酸(NT)蛋白表達(dá)升高至對(duì)照組的2.5倍。雙環(huán)醇200，300mg/kg給藥可顯著降低酒精引發(fā)的NO含量升高，使之接近正常水平，300mg/kg明顯抑制iNOS和NT蛋白的過表達(dá)(40％和53％)。 ALD中氧化/硝化應(yīng)激可引發(fā)線粒體損傷，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路。模型組小鼠肝臟線粒體對(duì)羅丹明123(R123)的攝取量明顯少于對(duì)照組，對(duì)高鈣濃度誘發(fā)腫脹的敏感性降低(50％)，提示線粒體發(fā)生

12、了膜滲透性轉(zhuǎn)換。雙環(huán)醇(200，300mg/kg)可顯著改善受損的線粒體功能，表現(xiàn)為線粒體對(duì)R123的攝取量以及高鈣濃度引發(fā)的吸光度下降幅度均明顯增加。此外，模型組線粒體呼吸鏈功能受到明顯抑制，線粒體呼吸鏈復(fù)合物(MRC)Ⅰ和MRCⅣ活性分別下降為正常對(duì)照組的42％和70％。雙環(huán)醇300mg/kg給藥后MRCⅠ和MRCⅣ活性較模型組均有明顯升高，分別恢復(fù)至對(duì)照組的65％和85％。線粒體損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放入胞漿，表現(xiàn)為模型組肝臟胞

13、漿細(xì)胞色素C蛋白含量增加至正常對(duì)照組的2倍。雙環(huán)醇給藥組胞漿細(xì)胞色素C蛋白含量幾乎接近正常水平。Bax和Bcl—XS/L分別為重要的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，模型組兩種蛋白表達(dá)均上調(diào)，分別達(dá)到對(duì)照組的1.6倍和3.1倍。雙環(huán)醇300mg/kg對(duì)Bax和Bcl—XS/L的過表達(dá)均有一定抑制作用。 Fas/Fas配體(FasL)參與死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路。模型組肝臟Fas、膜結(jié)合型FasL(mFasL)、可溶性FasL(sFas

14、L)蛋白表達(dá)分為上調(diào)為對(duì)照組的1.5倍、4和2倍。雙環(huán)醇300mg/kg可使Fas表達(dá)降低為模型組的45％，mFasL和sFasL的表達(dá)恢復(fù)正常水平。模型組肝臟細(xì)胞核中核因子—κB(NF—κB)的蛋白表達(dá)也有明顯變化，即降至對(duì)照組的16％，此外胞漿抑制蛋白—κB(ⅠκB)的蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加15％。雙環(huán)醇300mg/kg可使NF—κB蛋白表達(dá)維持在正常水平，同時(shí)抑制ⅠκB的過表達(dá)(50％)。 由此可見，雙環(huán)醇對(duì)酒精所致肝細(xì)胞凋

15、亡有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與影響酒精代謝酶活性和/或表達(dá)、抑制氧化/硝化應(yīng)激，改善線粒體損傷，減輕Fas/FasL過表達(dá)，從而同時(shí)抑制內(nèi)源性、外源性凋亡信號(hào)通路有關(guān)。 綜上所述，雙環(huán)醇對(duì)酒精引起的小鼠肝臟損傷具有明顯的保護(hù)作用。其不僅可抑制血清轉(zhuǎn)氨酶升高、肝臟甘油三酯蓄積，還可改善肝細(xì)胞腫脹、水樣和髓樣變性、炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)損傷。此外，雙環(huán)醇對(duì)肝細(xì)胞凋亡也有顯著的抑制作用，其保護(hù)作用的機(jī)制可歸納為： 1)酒精代謝酶調(diào)

16、控：抑制ADH和ALDH活性，抑制CYP2E1活性并下調(diào)蛋白表達(dá)。 2)抑制氧化應(yīng)激：減輕脂質(zhì)過氧化，恢復(fù)GSH含量，改善抗氧化物酶SOD、GSH-Px、GR、CAT的活性，減少氧化蛋白含量，恢復(fù)NAD+/NADH 3)抑制硝化應(yīng)激：降低NO水平，抑制iNOS和NT蛋白過表達(dá) 4)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)：下調(diào)TNF-α、IL-1β蛋白和mRNA表達(dá) 5)抑制Kupffer細(xì)胞活化：降低內(nèi)毒素水平，抑制CD—