汞誘導(dǎo)肝腎損傷機(jī)制及蘆丁的保護(hù)作用.pdf

1、背景：經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，給人們帶來方便的同時，也導(dǎo)致環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，環(huán)境污染正在危害全人類的健康，其造成的健康影響已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一。環(huán)境污染物種類很多，重金屬就是其中一大類，如汞、鉛、鎘等。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡等與重金屬引起機(jī)體多個臟器損傷的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)汞及其化合物可通過氧化應(yīng)激、炎癥等對機(jī)體腎、肝和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。目前對汞誘導(dǎo)的肝損傷并無特效的預(yù)防治療方法。

2、很多研究報道，一些具有抗氧化作用的物質(zhì)，如維生素E、硒、NAC、槲皮素等，可通過抑制氧化應(yīng)激對氯化汞（HgCl2）誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用，提示氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激可能是汞中毒損傷的主要機(jī)制。蘆丁，作為一種重要的、人們生活中接觸較多的類黃酮類物質(zhì)，具有多種生理、藥理功能，如抗驚厥、抗抑郁、抗菌、抗炎、抗氧化等作用。大量文獻(xiàn)和研究提示，蘆丁對STZ誘導(dǎo)的糖尿病具有治療作用；對多種毒物誘導(dǎo)的胃腸道損傷也具有輔助治療和預(yù)防的作

3、用；對CCl4、乙醇誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。蘆丁可以通過抑制脂質(zhì)聚集，增強(qiáng)AMPK的活性，增強(qiáng)PPARα的表達(dá)和抗氧化酶的活性發(fā)揮保肝作用。蘆丁可以通過增強(qiáng)PC12細(xì)胞中的PI3k/AKT/mTOR和ERK1/2的磷酸化水平發(fā)揮對SNP誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用；蘆丁可以通過激活MAPK信號通路及BDNF基因表達(dá)發(fā)揮對β淀粉酶誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。那么，蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)的肝腎損傷有沒有保護(hù)作用呢？MAPKs和PI3k/Akt信號通路是調(diào)

4、節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡過程非常重要的分子通路，在蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)肝腎損傷的保護(hù)作用中發(fā)揮什么樣的功能呢？本研究明確了HgCl2可誘導(dǎo)機(jī)體肝腎損傷，并結(jié)合蘆丁本身具有的抗氧化、抗炎作用、保肝作用，探索蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)肝腎損傷的預(yù)防作用及其相關(guān)機(jī)制，明確 PI3k/Akt，MAPKs信號通路在蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中的功能。綜上所述，面對目前嚴(yán)重的環(huán)境污染及人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|低劑量汞的現(xiàn)實狀況，蘆丁作為一種人們生活中接觸頻繁的抗氧化物質(zhì)，會

5、對HgCl2導(dǎo)致的肝腎損傷起到一定的預(yù)防和保護(hù)作用。
　　目的：
　　1、探討HgCl2誘導(dǎo)的肝、腎損傷特點，明確HgCl2誘導(dǎo)肝腎損傷的機(jī)制；
　　2、探討汞誘導(dǎo)肝、腎損傷以及蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中ERK和Akt信號分子的作用；
　　3、探索HgCl2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的劑量效應(yīng)以及蘆丁的劑量依賴性保護(hù)作用；
　　4、明確蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中，ERK、Akt磷酸化與凋亡、氧化應(yīng)激的關(guān)系。
　　方法：<

6、br>　　1、蘆丁對Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)肝損傷保護(hù)作用的體內(nèi)實驗：實驗大鼠為為正常組、Rutin組、HgCl2染毒組、HgCl2+Rutin組，實驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。第4天起（1）正常組：早8時腹腔注射生理鹽水約2ml，第5-7天每天早8時灌胃給予含5％DMSO的生理鹽水。（2）Rutin組：早8時腹腔注射生理鹽水約2ml，第5-7天每天早8時，灌胃給予蘆丁溶液（150mg/kg）。（3）HgCl2組：早8時腹腔注射HgCl2

7、鹽溶液（1.5mg/kg），第5-7天每天早8時灌胃給予含5%DMSO生理鹽水。（4）HgCl2+Rutin組：早8時腹腔注射HgCl2鹽溶液（1.5mg/kg），第5-7天每天早8時灌胃給予蘆丁溶液（150mg/kg）。實驗持續(xù)周期為4天。最后一次給予蘆丁后，禁食約8小時后稱量體重，腹腔注射苯巴比妥鈉（60mg/kg）麻醉后，打開腹腔抽取腹主動脈血，并去除肝臟、腎臟稱重并記錄。大生化儀檢測血清ALT、AST、ALB等評價肝功能的指標(biāo)。

8、采用DHE探針檢測肝冰凍切片ROS的水平，利用試劑盒檢測肝組織GSSG含量和MDA水平評價氧化應(yīng)激損傷。試劑盒檢測肝CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值，Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)水平，評價蘆丁對HgCl2導(dǎo)致肝抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá)水平，評價蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)變化的影響。最后通過Western Blot檢測

9、Akt和Erk的磷酸化水平的變化。
　　2、蘆丁對Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)腎損傷影響的體內(nèi)實驗：動物分組及處理同前。最后一次給藥結(jié)束后，禁食8小時，稱量動物體重，處死動物并稱其腎重。血清UREA、CRE等腎功能的指標(biāo)采用大生化儀檢測。腎冰凍切片ROS的水平，采用DHE探針檢測。利用試劑盒檢測氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo)，GSSG含量和MDA水平。試劑盒檢測CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值，Wes

10、tern Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)水平，評價蘆丁對HgCl2導(dǎo)致腎抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá)水平，評價蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)變化的影響。最后通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平的變化。
　　3、Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)肝損傷體外實驗：L02細(xì)胞暴露于1-150μM的HgCl2處理3、4、5、6、7、8小時，誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。MTT檢測細(xì)

11、胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細(xì)胞凋亡。采用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　4、蘆丁對Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用的體外實驗：實驗分組：Con， Ru，HgCl2，20μMRu+HgCl2，40μMRu+HgCl2，60μMRu+HgCl2。L02細(xì)胞先給于不同濃度蘆丁20μM、40μM、60μM，預(yù)處理12小時，再暴露于60μM的HgCl2，處理6小時，觀察蘆丁的保護(hù)作用

12、。MTT檢測細(xì)胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細(xì)胞凋亡。DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位（MMP）。用活體細(xì)胞線粒體膜孔通道熒光檢測試劑盒檢測細(xì)胞線粒體膜孔通道活性（MPTP）。試劑盒檢測GSSG含量和MDA水平，評價細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。試劑盒檢測CAT和T-SOD活力、GSH含量以及GSH/GSSG比值，Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)，評價蘆丁對HgCl2誘

13、導(dǎo)肝細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá)，評價蘆丁對HgCl2誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平變化的影響。通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平。使用PI3K和Erk的抑制劑LY294002和U0126后，MTT檢測細(xì)胞活力，Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)及凋亡家族蛋白表達(dá)水平，明確蘆丁是通過激活A(yù)kt和Erk的磷酸化，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能，抑制凋亡發(fā)生，發(fā)揮對

14、HgCl2導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：
　　1、蘆丁對Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)大鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用。蘆丁改善了HgCl2導(dǎo)致的大鼠體重增加的減少、肝體比增加；改善了HgCl2誘導(dǎo)的肝功能、氧化應(yīng)激損傷；提高了相關(guān)抗氧化蛋白的表達(dá)以及抗氧化酶的含量與活力；改善了肝內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變；蘆丁在一定程度上改善了HgCl2導(dǎo)致的大鼠肝組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。
　　2、蘆丁對Hg2+（

15、HgCl2）誘導(dǎo)大鼠腎損傷有一定的保護(hù)作用。蘆丁改善了HgCl2導(dǎo)致的大鼠體重增加的減少、腎體比增加；改善了HgCl2誘導(dǎo)的腎功能的改變、氧化應(yīng)激損傷；提高了抗氧化蛋白的表達(dá)及抗氧化酶的含量與活力；改善了腎內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變；蘆丁在一定程度上改善了HgCl2導(dǎo)致的大鼠腎組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。
　　3、Hg2+（HgCl2）處理L02細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性降低細(xì)胞活力下降，劑量依賴性導(dǎo)致細(xì)胞

16、凋亡增加、活性氧水平升高，并建立良好的肝細(xì)胞損傷模型。
　　4、蘆丁預(yù)處理能夠減輕Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。蘆丁預(yù)處理能夠改善HgCl2導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低，與HgCl2損傷組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；還可抑制HgCl2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加（P＜0.05）；緩解CAT、GSH、T-SOD等的活性/含量的降低（P＜0.05）；SOD2、CAT、Nrf2的蛋白表達(dá)水平升高，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能。

17、
　　5、蘆丁預(yù)處理能夠抑制Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。蘆丁預(yù)處理顯著抑制HgCl2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，與HgCl2組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；蘆丁預(yù)處理導(dǎo)致Bcl2的表達(dá)水平上升，Bax表達(dá)水平下降，Bax/Bcl2比值降低，與HgCl2組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Caspase3表達(dá)水平也有所下降。
　　6、蘆丁預(yù)處理能夠改善Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體功能障礙。蘆丁預(yù)處理

18、改善了HgCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的下降和線粒體膜孔通道活性的降低。
　　7、蘆丁預(yù)處理改善了Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。蘆丁預(yù)處理后，肝細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平與HgCl2相比顯著升高（P＜0.05），Akt磷酸化水平與HgCl2組相比亦有所改善，但不顯著。
　　8、ERK抑制劑（U0126）和PI3K抑制劑（LY294002）可在一定程度上消除蘆丁對Hg2+（HgCl2）誘導(dǎo)的肝細(xì)

19、胞活力下降的改善作用。U0126、LY294002前處理細(xì)胞組，抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)降低，與蘆丁預(yù)處理組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與HgCl2組Bcl2的表達(dá)相當(dāng)；BAX/Bcl2比值，與蘆丁處理組相比顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。用ERK和PI3K抑制劑前處理細(xì)胞組，SOD1、SOD2及CAT的蛋白表達(dá)水平與蘆丁預(yù)處理相比有所降低，與HgCl2組三類蛋白的表達(dá)水平基本一致。即蘆丁可通過激活ERK、Akt信

20、號分子磷酸化，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對HgCl2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1、HgCl2可破壞機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷，凋亡發(fā)生。
　　2、HgCl2可在一定程度上抑制ERK和Akt磷酸化，參與組織及細(xì)胞損傷。
　　3、蘆丁可增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能、減少ROS產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性，減緩組織損傷及細(xì)胞凋亡。
　　4、蘆丁可能通過激活ERK和Akt磷