雙環(huán)醇對小鼠急性肝衰竭的保護作用及機制研究.pdf

1、急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是起病急且持續(xù)進展的可逆性肝功能不全。由于肝臟合成、代謝、轉運和排泄等功能發(fā)生嚴重障礙，發(fā)病4周內可發(fā)生肝性腦病，并伴隨嚴重凝血障礙、黃疸、腹水，最終出現多器官衰竭而導致死亡。ALF的發(fā)病機制目前尚未完全明了，大多認為與內毒素血癥、炎性細胞激活及炎癥介質分泌、免疫和線粒體損傷以及能量代謝障礙等密切相關。目前ALF的治療除肝移植和N-乙酰半胱氨酸(撲熱息痛中毒的解毒劑)能使死亡率

2、略有降低外，并無其他有效治療措施。如不施行肝移植術，死亡率可高達80％-90％。病因的多樣性、發(fā)病機制的復雜性和病情的急驟進展使ALF死亡率一直居高不下而成為臨床和相關學科的研究熱點。因此，尋找治療ALF的有效藥物具有重要的臨床意義。 雙環(huán)醇是具有我國自主知識產權、治療慢性病毒性肝炎的國家一類新藥。臨床試驗結果顯示，雙環(huán)醇可明顯改善慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者的臨床癥狀并降低升高的血清轉氨酶，同時兼有一定抗乙型肝炎病毒作用。以

3、往藥理研究表明，雙環(huán)醇對多種化學毒物如四氯化碳、D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GaIN)等所致肝損傷及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、ConA引起的免疫性肝炎均有明顯的保護作用，其保肝作用機制與清除自由基、保護線粒體功能和調節(jié)前炎癥因子水平密切相關。雙環(huán)醇對實驗性ALF的作用尚未見研究報道。 己知ALF的病因不僅是判斷預后的指標，也是進一步治療的重要依據。據臨床統(tǒng)計，ALF最常見病因為

4、病毒性肝炎，其次為撲熱息痛(acetaminophen，APAP)中毒。因此，本研究根據雙環(huán)醇的藥理作用特點，應用LPS／GalN和APAP兩種常見ALF誘因引起的急性實驗性肝衰竭動物模型，觀察雙環(huán)醇對不同病因引起的ALF是否具有保護作用，并進一步探討其相關作用機制。 1．雙環(huán)醇對LPS／GalN誘導小鼠急性肝衰竭的保護作用及機制研究 GalN(800 mg／kg)致敏小鼠注射小劑量LPS(15μg／kg)可導致急性肝衰

5、竭，肝臟生物化學及代謝方面的改變與臨床病毒性ALF較為相似，可同時出現內、外源性內毒素血癥。因此本研究應用12S／GalN誘導的小鼠ALF模型，探討雙環(huán)醇對病毒性肝衰竭的保護作用及相關作用機制。 GaIN致敏動物注射LPS后導致嚴重的肝損傷可表現為血清轉氨酶升高(ALT升高20倍，AST升高2倍)、凝血酶原時間延長(28％)、凝血酶原活動度降低(62％)、高膽紅素血癥以及肝組織出現嚴重出血和壞死，甚至引起70％動物死亡。雙環(huán)醇預

6、防和治療給藥(150，300 mg／kg)均可顯著降低LPS／GalN引起的小鼠血清ALT、AST。及TBil異常增高，肝組織形態(tài)學病變也明顯改善，并呈一定的劑量效應關系。雙環(huán)醇300mg／kg預防和治療給藥還分別使延長的PT縮短13％和9％，使PTA提高56％和32％。此外，雙環(huán)醇預防給藥還可明顯減少LPS／GalN引起的動物死亡，使死亡率降至25％。 LPS／GalN誘導肝衰竭的損傷機制中，抗炎因子與前炎癥因子水平失衡是產生

7、炎性損傷的主要因素。注射LPS／GalN后，小鼠前炎癥因子TNF-α、IFN-γ水平顯著升高，分別為正常組的14倍和18.7倍；而抗炎因子IL-10水平有輕度升高，為正常組的2.1倍。雙環(huán)醇300mg／kg預防或治療給藥可抑制LPS／GaIN引起的血清TNF-α、IFN-γ水平升高，使TNF-α水平分別降低70％和82％；IFN-γ降低至正常水平。雙環(huán)醇還可明顯提高IL-10水平(兩給藥組分別升高20％和22％)。 CD14、T

8、LR4是組成LPS受體的關鍵部分，在LPS信號轉導途徑中起重要作用。黏附分子ICAM-1／LFA-1則可介導肝臟炎性反應時的細胞黏附，導致細胞毒性肝細胞損傷。小鼠注射LPS／GalN后，肝組織ICAM-1、LFA-1、CD14及TLR4 mRNA的表達明顯增加；其中CD14及TLR4 mRNA表達分別增加了46％和39％。雙環(huán)醇300mg／kg預防或治療給藥均可不同程度地減少上述分子在肝組織的異常表達。 由此可見，雙環(huán)醇對12S

9、／GalN引起的小鼠急性肝衰竭具有明顯預防和治療作用，其作用機理與抑制LPS受體CD14、TLR4的表達，從而下調前炎癥因子TNF-α和IFN-γ水平，上調抗炎因子IL-10水平，降低黏附分子ICAM-1和LFA一1的表達密切相關。 2．雙環(huán)醇對APAP誘導小鼠急性肝衰竭的保護作用及機制研究 APAP過量中毒是急性肝衰竭的另一臨床常見病因，由其引起的急性肝衰竭的發(fā)生率和死亡率一直居高不下。與病毒性肝炎誘發(fā)的肝衰竭比較，兩

10、者的發(fā)病機理既有共性又各具特點。因此本實驗應用APAP中毒所致小鼠肝衰竭模型，研究雙環(huán)醇的肝保護作用特點以及相關作用機制。 小鼠腹腔注射APAP(260 mg/kg)可導致嚴重的肝損傷，除血清轉氨酶異常升高及高膽紅素血癥外，糖原和蛋白水平也顯著降低(分別降低34％和66％)。同時，肝組織出現嚴重出血和壞死，大劑量(300mg/kg,ip)還可引起90％動物死亡。雙環(huán)醇預防和治療給藥(150，300mg／kg)均可顯著降低APAP

11、引起的小鼠血清ALT、AST及TBil異常增高，減輕肝組織壞死和炎癥細胞浸潤，并呈一定的劑量效應關系。同時，雙環(huán)醇還可抑制肝臟蛋白質和糖原水平下降，調節(jié)血糖水平。此外，雙環(huán)醇(300mg／kg)預防和治療給藥可將APAP引起的動物死亡分別降至20％和40％。 氧化/硝化應激是APAP引起嚴重肝損傷的重要機制之一。模型組小鼠可見血清NO、MPO水平及iNOS活性明顯升高，分別為正常組的1.5倍、2.3倍和2倍。肝臟iNOS及硝基酪

12、氨酸(NT)蛋白表達也顯著增強，為正常組的1.4倍及3.8倍。雙環(huán)醇300mg／kg預防及治療給藥可明顯降低APAP引起的NO、MPO水平升高，抑制肝臟iNOS的活性及過度表達，將增強的NT表達降至正常水平。體外實驗結果顯示，雙環(huán)醇5、10、50及100 uM皆可抑制APAP引起的肝細胞損傷、ALT異常升高及GSH含量下降，且呈一定濃度－效應關系。 APAP中毒還可導致線粒體功能損傷及能量代謝障礙。小鼠腹腔注射APAP后，ATP

13、ase活性降低為正常組的47％，雙環(huán)醇(300mg／kg)預防和治療給藥可使．ATPase活性分別提高49％和53％。 線粒體功能損傷還可誘發(fā)線粒體滲透性轉換(MPT)的發(fā)生。小鼠注射APAP后出現膜電位異常，對熒光探針Rodamine 123攝取量及攝取速率遠小于正常組(熒光值下降幅度正常組-1059．53vsAPAP組-477．56)。此外，對低pH值和高鈣濃度反應液誘發(fā)腫脹的敏感性也相應降低，吸光度下降幅度僅為正常組的14

14、％和5％，且在較短時間內即達到平衡。雙環(huán)醇(300mg/kg)預防及治療給藥可明顯改善受損線粒體的功能，保持相對正常的膜電位和膜的完整性，表現為線粒體對熒光素的攝取數量有所恢復和熒光值出現回升現象；對低pH值引發(fā)的吸光度下降幅度可恢復并接近正常水平，對高鈣引發(fā)的吸光度下降幅度明顯回升為正常組的43％和35％。 小鼠注射APAP后血清前炎癥因子水平變化明顯。血清IL-1β在APAP注射后1h即有升高，12h達峰，約為正常水平的20

15、000倍(正常組0.02pg/m1 Vs APAP組435.79pg/m1)。雙環(huán)醇300mg/kg預防及治療給藥在APAP注射后各時間點均可顯著抑制IL-1β的異常升高。與模型組比較，12h時間點兩給藥組IL-1β水平分別降低了53％和40％。同時，小鼠血清MIP-2水平也于注射APAP后12h達峰，約為正常水平的1500倍(正常組0.26pg/ml vs APAP組450.99pg/m1)。雙環(huán)醇(300mg/kg)預防及治療給藥在

16、各時間點均可顯著抑制其水平異常升高；在12h時間點兩給藥組MIP-2水平分別降低了84％和78％。 由此可見，雙環(huán)醇預防給藥及治療給藥對APAP引起的小鼠肝衰竭和死亡具有良好的保護作用，其肝保護作用機制主要是通過抑制iNOS的活性和表達上調從而降低NO水平、抑制MPO升高及GSH耗竭減輕氧化應激；通過下調NT表達而抑制硝化應激；維持線粒體膜的完整性和正常膜電位、提高ATPase的活性而改善線粒體功能；降低前炎癥因子水平而發(fā)揮抗炎