CpG-ODN對(duì)HepG2細(xì)胞及其相關(guān)因子的作用研究.pdf

1、目的：
　　 研究未甲基化CpG寡核苷酸（CpG-ODN）對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用：一方面包括CpG-ODN通過(guò)具有TLR9陽(yáng)性表達(dá)（TLR9+）的人外周血單核細(xì)胞（PBMC）對(duì)HepG2的間接作用，另一方面包括CpG-ODN對(duì)TLR9+HepG2細(xì)胞的直接作用，以此對(duì)CpG-ODN在腫瘤免疫治療中的安全性作出初步評(píng)價(jià)。
　　 方法：
　　 主要包括三方面：1）提取含有CpG-ODN的質(zhì)粒，用質(zhì)粒CpG-ODN

2、、多肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激PBMC，之后與HepG2共孵育，分別提取兩種細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)合成MyD88、Caspase-8的PCR引物，以得到的cDNA為模版，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MyD88、Caspase-8的表達(dá)情況；2）使用磷硫酰CpG-ODN刺激TLR9+細(xì)胞，即PBMC和HepG2，提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)合成抗凋亡因子Bcl-xL、Bcl-2，凋亡因子

3、Bid以及TLR9的PCR引物，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Bcl-xL、Bid、Bcl-2、TLR9的表達(dá)情況；3）使用磷硫酰CpG-ODN刺激HepG2，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：
　　 1、質(zhì)粒CpG-ODN能誘導(dǎo)與HepG2共孵育后的PBMC高表達(dá)MyD88，間接影響HepG2中MyD88、Caspase-8的表達(dá)；
　　 2、CpG-ODN對(duì)PBMC中Bcl-

4、xL、Bid表達(dá)有一定影響，對(duì)HepG2中Bcl-xL、Bcl-2、Bid表達(dá)的影響較明顯，即當(dāng)CpG-ODN的濃度在0～3μM范圍內(nèi)升高時(shí)，HepG2中抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2的mRNA水平有降低趨勢(shì)，凋亡因子Bid有增高趨勢(shì)，抗凋亡因子與凋亡因子的比率減??；
　　 3、正常狀態(tài)HepG2在0.5～2.5μM CpG-ODN作用下，細(xì)胞周期無(wú)明顯變化；在2.5～25μM CpG-ODN作用下，HepG2細(xì)胞周期中的

5、G1期增大，S+G2/M期減?。辉?5～50μM CpG-ODN作用下，G1期減小，S+G2/M期增大；
　　 4、生長(zhǎng)狀態(tài)不良的HepG2在CpG-ODN作用下，凋亡率APO明顯增大，且呈劑量-效應(yīng)依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭分子——MyD88，該信號(hào)通路的激活可能是質(zhì)粒CpG-ODN刺激PBMC殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制之一，此外PBMC殺傷HepG2的分子機(jī)制中可能涉及HepG2中

6、Caspase-8的表達(dá)；CpG-ODN可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族成員表達(dá)而有誘導(dǎo)HepG2凋亡的趨勢(shì)，這包括Bcl-xL、Bcl-2、Bid；在HepG2狀態(tài)正常條件下，低濃度CpG-ODN（0.5～2.5μM）對(duì)HepG2細(xì)胞周期的作用不明顯，中濃度CpG-ODN（2.5～25μM）對(duì)HepG2的增殖有一定的抑制作用，高濃度CpG-ODN（25～50μM）有促進(jìn)HepG2增殖的趨勢(shì)；在HepG2狀態(tài)不良條件下，CpG-ODN可以促