甘油誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠腎組織中Megalin和FUT8的表達及山莨菪堿干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:過度訓(xùn)練引起橫紋肌溶解(rhabdomyolysis，RM)，可導(dǎo)致急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)。而急性腎損傷作為腎臟內(nèi)科最重要的急危重癥，對其有效治療是世界性難題。如何防治并早期干預(yù)過度訓(xùn)練所致急性腎損傷已成為運動醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的重要課題。
　　 在過度訓(xùn)練引起橫紋肌溶解導(dǎo)致急性腎損傷的發(fā)病過程中，肌紅蛋白的腎毒性是引起急性腎損傷的重要原因。而肌紅蛋白的吸收依靠的是腎小管近

2、端的Megalin糖蛋白，但其具體的致病分子機制及早期干預(yù)處理的分子靶位點研究報道很少。本實驗通過采用甘油誘導(dǎo)大鼠橫紋肌溶解致急性腎損傷模型，觀察其生化指標(biāo)的變化，檢測腎組織Megalin及對Megalin有調(diào)節(jié)翻譯后修飾功能的a-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的表達變化以及山莨菪堿對上述指標(biāo)變化的影響，為進一步研究AKI的發(fā)病機制，并尋找早期藥物干預(yù)靶位點和有效的防治措施提供實驗及理論依據(jù)。
　　 方法:(1)健康雄性SD

3、大鼠42只，體重200-220g，采用完全隨機分組方式分為3組:對照組(Control，CN,n=6)、急性腎損傷模型組(acutekidneyinjury,AKI，n=18)、山莨菪堿干預(yù)組(anisodamine，AD，n=18)。AKI組和AD組根據(jù)甘油作用時間又分為三個亞組即1h、6h組和24h組，每組6只大鼠。(2)采用給大鼠雙后肢肌肉注射甘油生理鹽水建立橫紋肌溶解致急性腎損傷模型。(3)使用全自動生化儀檢測生化指標(biāo)血肌酐(S

4、cr)、尿素氮(BUN)及肌酸激酶(CK)，應(yīng)用ELISA法檢測血清肌紅蛋白Mb;應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用免疫組化和圖像分析檢測腎組織中Megalin和FUT8的表達;應(yīng)用WesternBlot方法檢測FUT8的表達。(4)統(tǒng)計分析:所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間同一時間比較采用配對t檢驗，相

5、關(guān)分析采用Pearson相關(guān)檢驗，以p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1)血生化指標(biāo):AKI組肌注甘油6小時、24小時后血清BUN、Scr、Mb與CN組比較均明顯升高(p＜0.05），于24小時后達到高峰(p＜0.05);血清CK于肌注甘油1小時后即明顯升高，6小時后達到高峰(p＜0.05)，24小時后回落;AD亞組與同期AKI組比較，各指標(biāo)水平均顯著降低(p＜0.05)。(2)光鏡觀察顯示:CN組大鼠腎組織未見明顯

6、病理學(xué)改變;隨著甘油作用時間的延長，AKI組病理損傷逐漸加重，于24h組可見大量腎小管上皮細胞胞核深染及固縮，腎小管上皮細胞壞死、崩解，不規(guī)整脫落，管腔內(nèi)出現(xiàn)大量由蛋白、脫落的上皮細胞碎片形成的管型，間質(zhì)可見毛細血管充血，大量炎性細胞浸潤，部分腎小管塌陷閉塞。與AKI組比較，AD亞組各時點病理學(xué)改變均有所減輕。(3)免疫組化結(jié)果:①Megalin的表達:陽性表達為細胞胞漿著色為深棕色粗顆粒狀，著色部位主要見于腎小管上皮細胞胞漿近基底膜部

7、位，腎小球及間質(zhì)偶見表達。CN組大鼠腎組織中Megalin有弱表達，AKI組隨甘油作用時間的延長，表達逐漸增強，肌注甘油1h后Megalin有少量表達(p＜0.05），6h后表達量及面積明顯增強(p＜0.05)，24h后達高峰(p＜0.05)。AD亞組均較同期AKI組表達減弱(p＜0.05)。②FUT8的表達:陽性表達為細胞胞漿著色為棕黃色，主要見于腎小管上皮細胞胞漿近基底膜部位，腎小球及間質(zhì)偶見表達。CN組大鼠腎組織中FUT8有弱表達

8、，AKI組隨甘油作用時間的延長，表達逐漸增加(p＜0.05），于肌注甘油24h后達到高峰(p＜0.05），AD亞組表達均弱于同期AKI組(p＜0.05)。對圖像進行半定量分析，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。(4)WesternBlot結(jié)果:在內(nèi)參GAPDH表達量基本一致的情況下，CN組大鼠FUT8條帶顏色較淺，AKI組隨甘油作用時間的延長，條帶顏色逐漸加深（p＜0.05），于肌注甘油24h后條帶最深（p＜0.05）。AD亞組

9、均較同期AKI組條帶顏色淺，對其進行半定量分析，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(5)相關(guān)性分析:血清Mb水平與BUN、Scr呈顯著正相關(guān)(r=0.872，p＜0.05;r=0.716，p＜0.05);與腎組織Megalin、FUT8蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.843，p＜0.05;r=0.802，p＜0.05);Megalin與FUT8蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.965，p＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.