過(guò)度訓(xùn)練大鼠腎組織熱休克蛋白70的表達(dá)及山莨菪堿干預(yù)的研究.pdf

1、目的：近年來(lái)對(duì)過(guò)度訓(xùn)練引起的急性腎損傷(overtraining-inducedacute kidney injury，OTIAKI)的研究越來(lái)越多，因?yàn)樗殉蔀槲：θ祟?lèi)健康的重要疾病，但其發(fā)病機(jī)制和損傷方式尚不清楚，目前尚缺乏有效的防治方法。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱(chēng)應(yīng)激蛋白，它是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志及內(nèi)源性保護(hù)蛋白，其表達(dá)的強(qiáng)弱與組織細(xì)胞的損害程度有關(guān)。其中熱休克蛋白70(heat shoc

2、k protein70，HSP70)在生物細(xì)胞中含量最高，受到誘導(dǎo)最強(qiáng)，應(yīng)激后生成最顯著，具有多種生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞有明確的內(nèi)源性保護(hù)作用。本研究采取大鼠無(wú)負(fù)重單次游泳至力竭建立過(guò)度訓(xùn)練引起的急性腎損傷的模型，研究過(guò)度訓(xùn)練大鼠腎組織細(xì)胞HSP70的表達(dá)規(guī)律及其與腎組織細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并觀察山莨菪堿對(duì)HSP70表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體重180—220g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分

3、為三組：安靜對(duì)照組(CN，n=8)、力竭運(yùn)動(dòng)組(ES，n=24)、山莨菪堿干預(yù)組(AD，n=16)。安靜對(duì)照組(CN)未進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)，不注射任何藥物；力竭組又根據(jù)力竭后恢復(fù)時(shí)間不同分為力竭后即刻組(ESI)、力竭后6小時(shí)組(ES6h)和力竭后24小時(shí)組(ES24h)三個(gè)亞組，且各亞組大鼠在運(yùn)動(dòng)前20min給予滅菌注射用水10mg/Kg一次性腹腔注射；山莨菪堿干預(yù)組也根據(jù)力竭后恢復(fù)時(shí)間不同分為山莨菪堿6h組(AD6h)和山莨菪堿24h組(

4、AD24h)兩個(gè)亞組，各亞組大鼠于運(yùn)動(dòng)前20min給予山莨菪堿注射液10mg/Kg一次性腹腔注射。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為8只大鼠。采用大鼠無(wú)負(fù)重單次游泳至力竭建立過(guò)度訓(xùn)練引起急性腎損傷模型。
　　(2)于各時(shí)間點(diǎn)，5％的水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，摘取兩側(cè)腎臟，將左側(cè)腎臟放入EP管，迅速放入液氮中，-80℃冰凍保存，待用于Western blot技術(shù)檢測(cè)腎組織HSP70的表達(dá)。右側(cè)腎臟置于4℃4％多聚甲醛中固定，制作石蠟切片。<

5、br>　　(3)采用HE染色光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。
　　(4)采用免疫組化染色(PV法)觀察腎組織HSP70的表達(dá)情況，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。
　　(5)應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)腎組織HSP70表達(dá)的變化。
　　(6)統(tǒng)計(jì)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way AN

6、OVA)分析，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1)無(wú)負(fù)重單次游泳至力竭后大鼠表現(xiàn)為極度疲勞的神態(tài)，精神萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，胸腹著地，無(wú)法站立，活動(dòng)困難，嚴(yán)重者可有球結(jié)膜出血的現(xiàn)象。力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠約2h后方可自由活動(dòng)，進(jìn)食水情況欠佳，而山莨菪堿干預(yù)組大鼠約20min后可自由活動(dòng)，基本可正常進(jìn)食。
　　(2)正常對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。力竭后即刻組、力竭后6h組腎組織結(jié)構(gòu)改變輕微，有部分腎

7、小球囊、腎小管擴(kuò)張，近端腎小管上皮細(xì)胞水腫，出現(xiàn)空泡變性；力竭后24h組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯，在皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)可見(jiàn)大量細(xì)胞的細(xì)胞核深染及固縮現(xiàn)象，間質(zhì)可見(jiàn)浸潤(rùn)細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣出現(xiàn)不規(guī)整甚至脫落的改變。山莨菪堿6h組及山莨菪堿24h組較同期單純力竭組比較大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯減輕。
　　(3)免疫組化染色檢測(cè)腎組織HSP70的表達(dá)：陽(yáng)性細(xì)胞多為腎小管上皮細(xì)胞，腎小球幾乎無(wú)表達(dá)，且腎髓質(zhì)中的細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于腎皮質(zhì)。正常對(duì)

8、照組大鼠腎組織中有較弱的HSP70的表達(dá)。力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，腎組織HSP70蛋白的表達(dá)水平呈逐漸增高趨勢(shì)，且同正常對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山莨菪堿干預(yù)組大鼠腎組織中HSP70的表達(dá)較同期力竭組比較陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，且表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　(4)Western blot技術(shù)檢測(cè)腎組織HSP70的表達(dá)：在內(nèi)參GAPDH表達(dá)量基本一致的情況下，與正常對(duì)照組比較，隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，力竭運(yùn)動(dòng)組

9、腎組織HSP70表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。山莨菪堿6h組、山莨菪堿24h組較同期力竭組比較，腎組織HSP70表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)HSP70在過(guò)度訓(xùn)練大鼠腎組織中表達(dá)增強(qiáng)，且于力竭后即刻至力竭后24小時(shí)呈逐漸增高趨勢(shì)，用免疫組化法觀察腎髓質(zhì)中的細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于腎皮質(zhì)。
　　(2)山莨菪堿干預(yù)組與同期力竭組比較，腎組織損傷減輕，腎組織HSP70的表達(dá)增強(qiáng)，山莨菪堿對(duì)OTIAKI的保護(hù)作用有可能