KLOTHO基因在殘余腎模型大鼠中的表達及腎安顆粒的干預(yù)作用.pdf

1、腎性骨病(ROD)是慢性腎臟病的主要并發(fā)癥之一，對患者的生存質(zhì)量和生存時間有著重要影響。由于腎臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞導(dǎo)致腎臟羥化酶系的活性降低，1，25(OH)2VitD3的生成相對或絕對不足，PTH的合成與釋放失控，是ROD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。Klotho基因(KL)是一種與衰老相關(guān)的基因，主要在腎小管、腦脈絡(luò)膜和甲狀旁腺表達，尤以腎皮質(zhì)遠曲小管表達最為強烈。KL基因缺陷鼠可出現(xiàn)一系列與人類“腎精虧虛證”相似的衰老表型變化。研究證實，KL在慢

2、性腎臟病(CKD)腎組織中的表達明顯下調(diào)，而KL下調(diào)可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，說明KL可能參與發(fā)生ROD。另外，成纖維細胞生長因子23(FGF-23)、成骨蛋白-1(BMP-7)、骨保護素(OPG)作為調(diào)節(jié)骨和腸鈣磷轉(zhuǎn)運及骨代謝的激素，在ROD發(fā)生過程中起重要作用。那么，KL是否通過調(diào)控這些蛋白而參與發(fā)生ROD呢?如果能夠證實這一假說，將進一步闡明ROD的發(fā)病機制并為臨床治療提供新靶點。本研究采用大鼠5/6腎切除殘余腎模型，探討KL基因?qū)GF-

3、23、BMP-7、OPG的調(diào)控機制及腎安顆粒(復(fù)方淫羊藿苷、黃芪甲苷、大黃蒽醌提取物)的干預(yù)作用，預(yù)期結(jié)果不僅能深化對ROD發(fā)病機制的認識，還將在一定程度上揭示中藥防治ROD的作用機理。
　　 實驗一大鼠殘余腎模型的制備
　　 目的：探討大鼠殘余腎并腎性骨病模型的制備方法。
　　 方法：Wistar大鼠48只隨機分為正常對照組(A組，n=8)、假手術(shù)組(B組，n=8)、造模組(c組，n=32)。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后

4、，C組大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，行2/3左腎切除，1周后再次行右腎切除。各組大鼠均予正常飲食，A組和B組飲蒸餾水，C組左腎切除術(shù)后第二天開始加磷酸二氫鈉飲水。各組大鼠造模術(shù)后1月眼球取血，測定血紅蛋白(HGB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血磷(P3+)、血鈣(Ca2+)、血清堿性磷酸酶(ALP)、血清全段甲狀旁腺激素(iPTH)。取血前1天代謝籠收集24h尿，測尿肌酐(UCr)并計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。
　　

5、 結(jié)果：造模術(shù)后1月，A、B兩組大鼠活潑好動，毛色整齊光亮，體重增加；C組精神萎靡，安靜不喜動，毛色雜亂，體重變化不明顯。C組HGB與A組和B組比較明顯降低(P<0.05)；C組BUN、Scr與A組和B組比較明顯升高(P<0.01)，C組Ccr與A組和B組比較明顯降低(P<0.01)；C組ALP與A組和B組比較明顯升高(P<0.05)；C組iPTH與A組和B組比較顯著升高(P<0.01)；C組Ca2+與A組和B組比較明顯降低(P<0.

6、05)；C組P3+與A組和B組比較明顯升高(P<0.01)。A、B兩組間以上指標比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：5/6腎切除加高磷飲水1月可以導(dǎo)致殘余腎模型大鼠鈣磷代謝異常，繼發(fā)PTH升高，提示并發(fā)ROD。
　　 實驗二殘余腎模型鈣、磷代謝的變化及腎安顆粒的干預(yù)作用
　　 目的：探討殘余腎模型大鼠鈣、磷代謝的變化及腎安顆粒的干預(yù)作用。
　　 方法：將第一部分實驗中的造模組大鼠32只隨機分為

7、4組，即模型組(C組，n=8)、陽性藥物骨化三醇對照組(D組，n=8)、腎安顆粒中劑量組(E組，n=8)、腎安顆粒高劑量組(F組，n=8)。正常對照組(A組，n=8)、假手術(shù)組(B組，n=8)與第一部分相同。D組以骨化三醇溶液灌胃；E、F組分別以中、高濃度腎安顆粒灌胃；A、B、C組以等量生理鹽水灌胃。灌胃容量1ml/100g/日，總療程8周。用藥前后檢測各組大鼠血HGB、Scr、BUN、P3+、Ca2+、ALP、iPTH，取血前1天代謝

8、籠收集24h尿，測Ucr并計算Ccr。
　　 結(jié)果：各組大鼠存活情況：用藥期間C組和D組各死亡1只，余各組大鼠均存活。用藥前，C、D、E、F四組BUN、Scr、P3+與A、B兩組比較明顯升高，Ccr、Ca2+與A、B兩組比較明顯降低(P<0.05)，ALP與A、B兩組比較無明顯變化(P>0.05)。用藥8周后，A、B兩組HGB、BUN、Scr、Ccr、P3+、Ca2+、ALP、iPTH與用藥前比較無明顯變化(P>0.05)；C組

9、BUN、Scr、P3+、ALP、iPTH與用藥前比較明顯升高(P<0.05)，Ca2+、Ccr、HGB與用藥前比較明顯降低：D組Ca2+與用藥前比較明顯升高(P<0.05)，P3+較用藥前略下降但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組ALP與用藥前比較降低(P<0.05)，iPTH與用藥前比較明顯降低(P<0.01)；E組Ca2+與用藥前比較明顯升高(P<0.05)，P3+、ALP與用藥前比較明顯降低(P<0.05)，iPTH與用藥前比較顯

10、著下降(P<0.01)；F組Ca2+與用藥前比較升高明顯(P<0.05)，P3+、ALP與用藥前比較明顯降低(P<0.05)，iPTH與用藥前比較顯著降低(P<0.01)。用藥后，D組Ca2+與C組比較明顯升高(P<0.05)，ALP、iPTH與C組比較均明顯降低(P<0.05)，P3+與C組比較無顯著性差異(P>0.05)；E組Ca2+與C組比較明顯升高(P<0.05)，P3+、ALP、iPTH與C組比較均明顯降低(P<0.05或P<

11、0.01)；F組Ca2+與C組比較明顯升高(P<0.05)，P3+、ALP、iPTH與C組比較均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。用藥8周后，E、F兩組HGB、CCr與D組比較明顯升高(P<0.05)，Scr與D組比較明顯降低(P<0.05)，BUN與D組比較無顯著性差異(P>0.05)。E、F兩組Ca2+、ALP、iPTH與D組比較均無顯著性差異(P>0.05)，P3+與D組比較明顯下降(P<0.05)；E、F兩組間上述各指標比

12、較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：腎安顆粒具有穩(wěn)定殘余腎模型大鼠腎功能、提高HGB、改善鈣磷代謝、抑制甲狀旁腺機能亢進的作用。
　　 實驗三 KLOTHO基因在殘余腎模型大鼠的表達及腎安顆粒的干預(yù)作用
　　 目的：探討KL基因在殘余腎模型大鼠的表達及腎安顆粒的干預(yù)作用。
　　 方法：分組方法及用藥同第二部分。用藥結(jié)束后，處死全部大鼠，取腎臟和股骨，腎組織常規(guī)包埋切片染色行光學(xué)顯微鏡檢查，以雙能

13、X射線骨密度儀測定股骨頭部的骨密度。采用Real-timePCR檢測大鼠腎臟KLothomRNA的表達；采用Western blot檢測腎臟KLotho蛋白、股骨FGF-23、BMP-7、OPG蛋白水平；免疫組化法檢測股骨BMP-7、OPG表達；免疫熒光檢測股骨FGF-23表達。
　　 結(jié)果：骨密度：C組與A、B兩組比較明顯降低，E、F、D組與C組比較明顯升高(P<0.05)，E組與D組比較略有升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05

14、)，F(xiàn)組與D組比較無顯著性差異(P>0.05)。KLothomRNA：C組和D組的表達與A組和B組比較明顯減低(P<0.01或P<0.05)；E、F組表達與C組比較明顯增強(P<0.01)；E、F組兩組表達與D組比較明顯增強(P<0.05)。Klotho蛋白：A組的表達均高于其它各組，與C組相比明顯增高(P<0.01)；E、F組的表達與C組和D組比較明顯增高(P<0.05)；E組與F組間比較無差異性(P>0.05)。Western bl

15、ot及免疫熒光檢測FGF-23：C、D、F三組表達均明顯高于A組和B組(P<0.05或P<0.01)，E組表達與A組和B組比較無明顯差異(P>0.05)；D、E、F三組表達明顯低于C組(P<0.05)；E組表達低于D組和F組(P<0.05)。Western blot及免疫組化檢測BMP-7：在大鼠股骨中，C、D、F三組表達明顯低于A組和B組(P<0.05或P<0.01)，E組表達略低于A組和B組但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；D、E、F

16、三組表達與C組比較明顯升高(P<0.05)；E、F兩組表達高于D組(P<0.05)。Western blot及免疫組化檢測OPG：C組表達明顯低于A組和B組(P<0.05)；D、E、F三組表達明顯高于C組(P<0.05)；D、E、F三組間比較無顯著性差異(P>0.05)。KL表達與FGF-23、BMP-7、OPG表達的關(guān)系：在模型組，隨著KLotho表達的下調(diào)，F(xiàn)GF-23表達升高，BMP-7、OPG表達降低；腎安干預(yù)后，隨著KLoth