HIF-1α在實驗性SAH早期腦損傷中的調(diào)控及槲皮素作用研究.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的死亡率和致殘率都比較高,而且病例機制復雜。除了我們熟知的72小時腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)后腦缺血造成嚴重的遲發(fā)性腦損傷(delayed brain injury,DBI)外。最近研究發(fā)現(xiàn),72小時內(nèi)的早期腦損傷(early brain injury,EBI)包括腦灌注壓(cerebral perfusion pressure,CP

2、P)下降、離子失衡、谷氨酸毒性、氧化應激、炎性反應、血管內(nèi)皮損傷、血小板活化和聚集、通透性改變、細胞死亡通路激活等一系列的病理生理反應,導致認知障礙、神經(jīng)功能缺陷等,這對SAH的整體預后非常關鍵,并且,其中的分子機制是研究熱點。低氧誘導因子-1(hypo xia ind uc ib le fac tor-1,HIF-1)是氧敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,它調(diào)控的下游靶基因有70多個,包括血管內(nèi)皮生長因子、促紅細胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運體等等。HIF-

3、1包括 HIF-1和HIF-1β兩個亞基,已有研究顯示在局灶性腦缺血損傷動物模型中上調(diào)HIF-1的表達可以起到神經(jīng)保護作用,但是在SAH中關于HIF-1的表達調(diào)控以及它發(fā)揮的作用還沒有明確的報道。HIF-1的特異性抑制劑有叫YC-1的化合物,它的激動劑除了低氧環(huán)境外,已有少部分實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可以上調(diào)HIF-1的表達。槲皮素是黃酮類的成份之一,它有明確的分子式,不同的化學基起到不同的作用,它具有清除氧自由基(oxygen free rad

4、icals,ROS)、抑制脂質(zhì)過氧化(lipid peroxides,LPO)的抗毒抗氧化應激的作用,螯合鈣、鐵等離子以及修復損傷DN A的神經(jīng)保護等作用。在歐美等國家已經(jīng)作為藥物上市,國內(nèi)應用的銀杏葉提取物、銀杏達莫注射液等藥物,其中最重要的成份就是槲皮素,但是關于槲皮素在SAH中的作用及其機制尚未見到國內(nèi)外報道。因此,深入研究HIF-1及槲皮素在SAH后早期發(fā)揮的機制及它們的相互作用,對加強SAH后 EBI的保護有一定的作用。

5、>　　本研究共分五部分實驗,實驗一是關于HIF-1在實驗性SAH模型對大鼠海馬細胞凋亡和認知功能障礙保護作用的研究。首先建立成熟、穩(wěn)定、可重復的大鼠 SAH模型(枕大池二次注血模型),分為假手術組、SAH模型二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)對照組和YC-1抑制組共三組,YC-1為 HIF-1的特異性抑制劑,在 SAH模型建立的前30 min以及后24 h的時候,給大鼠腹腔注射2 mg/k g的YC-1(溶于DM

6、SO),DMSO對照組注射相同劑量的DMSO,假手術組腹腔未注射藥物。然后在48 h時,通過免疫組化和Western blot觀察HIF-1?和它的下游靶分子VEGF、EPO、GL U T1的在各組大鼠海馬的表達變化;進一步通過免疫組化觀察各組大鼠海馬C A1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學表達變化、Western blot檢測海馬Caspase-3的蛋白表達和酶聯(lián)免疫吸附測定法(e nzyme-linked immunoso rbe nt

7、 assay,ELIS A)測定海馬細胞死亡DNA斷片,通過統(tǒng)計分析,以明確各組大鼠海馬凋亡情況;最后通過Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)測定各組大鼠的逃避時間和路程、目標象限停留時間和距離,統(tǒng)計比較各組大鼠認知功能損傷變化。結果顯示在SAH模型建立48 h,大鼠海馬 HIF-1?和它的下游分子VEGF、EPO、GLUT1的表達增加(P<0.01),YC-1抑制組這四種分子的表達減少(P<0.01);在S

8、AH模型建立48 h,大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細胞增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達和細胞死亡的DNA斷片增加(P<0.01),與DMSO對照組相比,YC-1抑制組大鼠海馬C A1區(qū)的Caspase-3陽性細胞進一步增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達和細胞死亡的DNA斷片進一步增加(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠在MWM中的逃避時間和路程延長(P<0.01),在目標

9、象限的停留時間和距離增加(P<0.01),與DMSO對照組相比,YC-1抑制組大鼠在MWM中的逃避時間和路程進一步延長(P<0.01),在目標象限的停留時間和距離進一步增加(P<0.01)。實驗一的研究結果表明在大鼠SAH模型48 h,HIF-1?及其效應分子VEGF、EPO、GLUT1在海馬的表達增加,而抑制它們的表達會惡化海馬細胞的凋亡,降低大鼠的認知能力,這提示在SAH早期,HIF-1?可能參與了海馬細胞凋亡和認知功能損傷的保護。

10、
　　實驗二是關于 HIF-1?在實驗性SAH模型對大鼠血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血S AH模型,分為假手術組、DMSO對照組和YC-1抑制組共三組,給藥方案同實驗一;然后在48h時,通過Western b lot觀察HIF-1被YC-1抑制后各組大鼠腦Occludin、Claudin-5蛋白的表達變化;進一步通過伊文思藍(Eva ns b lue)染色觀察各組大

11、鼠腦藍染變化、分光光度計測定各組大鼠腦伊文思藍含量,通過統(tǒng)計分析,以明確各組大鼠BBB損傷變化情況。結果顯示在SAH模型建立48 h,BBB損傷的標志物Occludin和Claudin-5蛋白表達增加(P<0.01),YC-1抑制組大鼠腦Occludin和Claudin-5蛋白表達與DMSO對照組相比則明顯減少(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠腦的伊文思藍染色明顯,YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍染色與DMSO對照組相比則明顯

12、減淡,伊文思藍定量分析顯示在SAH模型建立48 h,大鼠腦的伊文思藍含量增加(P<0.01),YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍含量與DMSO對照組相比則明顯減少(P<0.01)。實驗二的研究結果表明在大鼠SAH模型48 h,HIF-1?的表達減少降低了BBB的通透性,減輕了BBB損傷,提示在SAH早期,HIF-1?可能參與并惡化了BBB的損傷。實驗一和實驗二的結果提示HIF-1?在SAH早期可能發(fā)揮了雙向調(diào)節(jié)作用。
　　實驗三是關于槲

13、皮素在實驗性SAH模型對大鼠腦氧化應激和腦水腫保護作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型,分為假手術組、S AH模型生理鹽水對照組、槲皮素10mg/k g劑量組、槲皮素50 mg/k g劑量組共四組,在SAH模型建立后30 min、12 h及24 h的時候,分別給槲皮素10 mg/k g劑量組和50 mg/k g劑量組大鼠腹腔按體重注射10 mg/k g和50 mg/k g的槲皮素,生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水,假

14、手術組腹腔未注射藥物。然后在48h時,通過改良的嚙齒類動物神經(jīng)系統(tǒng)功能評分表對各組大鼠進行評分,觀察神經(jīng)功能缺失情況(分數(shù)越高,神經(jīng)功能障礙越重);然后通過ELIS A對各組大鼠腦皮層抗氧化酶銅、鋅離子超氧化物歧化酶(CuZn-superoxide dismutase,CuZn-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GS H-Px)的測定,以及反映脂質(zhì)過氧化的指標丙二醛（ma lo na lde h

15、yde,MDA)的測定,明確槲皮素的抗氧化應激能力;進一步通過免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學表達變化、Western blot檢測海馬Caspase-3的蛋白表達,通過統(tǒng)計分析,以明確各組大鼠海馬凋亡情況;最后通過濕/干法測定各組大鼠的腦組織含水量,以明確各組大鼠的腦水腫情況。結果顯示在SAH模型建立48 h,大鼠神經(jīng)功能評分增加(P<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著

16、性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的神經(jīng)功能評分與生理鹽水對照組相比明顯降低(P<0.01);在 SAH模型建立48 h,大鼠腦皮層 CuZn-SOD和GSH-Px活性下降(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的腦皮層 CuZn-SOD和GSH-Px活性與生理鹽水對照組相比明

17、顯升高(P<0.01),MDA水平下降（P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細胞增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達增加(P<0.01),10mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),而50mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比,海馬C A1區(qū)的Caspase-3陽性細胞明顯減少(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋

18、白表達明顯降低(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠腦組織水含量增加(P<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的腦組織水含量與生理鹽水對照組相比明顯降低(P<0.01)。實驗三的結果表明在SAH模型建立48 h,50 mg/k g劑量的槲皮素可以增強大鼠腦的抗氧化應激酶活性及減輕脂質(zhì)過氧化程度,可以減輕海馬凋亡和腦水腫,并可以

19、減輕大鼠神經(jīng)功能障礙,但10 mg/k g劑量槲皮素沒有起到這些作用,提示在S AH早期,合適劑量的槲皮素治療可以通過抗氧化應激、抑制神經(jīng)元凋亡和減輕腦水腫等方面起到降低 SAH后EBI程度的作用。
　　實驗四是關于槲皮素在實驗性SAH模型對大鼠腦基底動脈(basilar artery,BA)腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型,分為假手術組、SAH模型生理鹽水

20、對照組、槲皮素10mg/kg劑量組、槲皮素50mg/k g劑量組共四組,在S AH模型建立前半個月的每天1次,建立后30 min、12 h及24 h的時候,分別給槲皮素10 mg/k g劑量組和50 mg/k g劑量組大鼠腹腔按體重注射10 mg/k g和50 mg/k g的槲皮素,生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水,假手術組腹腔未注射藥物;然后在72 h時,通過基底動脈切片的HE染色觀察各組大鼠BA管腔直徑、管壁厚度,并計算各組

21、大鼠BA面積進行比較;進一步通過Western blot檢測各組大鼠BA內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白的表達變化;最后通過ELISA測定各組大鼠血清eNOS的濃度。結果顯示在生理鹽水對照組,大鼠 BA管腔內(nèi)有血栓組織,血管壁的厚度增加,管腔直徑變短,BA面積變小（P<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),

22、而50 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比,血管壁的厚度增加,管腔直徑變長,BA面積變大(P<0.01);在SAH模型建立72 h,大鼠BA的eNOS蛋白表達減少(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比,大鼠BA的eNOS蛋白表達明顯增加(P<0.01);在SAH模型建立72 h,大鼠血清eNOS濃度降低

23、(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比,大鼠血清eNOS濃度明顯升高(P<0.01);實驗四的結果表明在SAH模型建立72 h,50mg/kg劑量的槲皮素治療可以增加大鼠BA中eNOS蛋白的表達和血清eNOS的濃度,可以緩解腦BA痙攣,但10mg/kg劑量槲皮治療可以通過增加BA內(nèi)eNOS蛋白的表達和提高血清eNOS

24、濃度等方面起到在SAH后早期抗CVS的作用。
　　實驗五是關于槲皮素在實驗性 SAH 模型對大鼠海馬 HIF-1?的調(diào)節(jié)作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血 SAH模型，分為假手術組、SAH模型生理鹽水對照組和槲皮素組共三組，在SAH模型建立前半個月的每天 1 次，建立后 30 min、12h及24h的時候，給槲皮素組大鼠腹腔按體重注射 50mg/kg的槲皮素，生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術組腹腔未注射藥物；然后

25、在 48 h 時，通過免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)HIF-1的形態(tài)學表達變化；進一步通過Western blot 檢測各組大鼠海馬HIF-1的蛋白表達變化。結果顯示在 SAH 模型建立 48 h，大鼠海馬CA1區(qū)的HIF-1陽性表達增多（P < 0.01），與生理鹽水對照組相比，槲皮素組大鼠海馬 CA1 區(qū)的HIF-1?陽性表達進一步增多（P < 0.01）；在 SAH 模型建立 48 h，大鼠海馬的HIF-1?蛋白增多（P < 0

26、.01），與生理鹽水對照組相比，槲皮素組大鼠海馬的HIF-1?蛋白進一步增多（P < 0.01）。實驗五的研究結果表明在大鼠SAH模型48h，槲皮素可以上調(diào) HIF-1?在海馬的表達，這提示在SAH早期，槲皮素也可能通過HIF-1?這一途徑發(fā)揮了腦保護作用。
　　本論文首次在大鼠SAH模型早期，觀測了HIF-1對海馬凋亡、認知功能和BBB功能的影響，并檢測了槲皮素對腦氧化應激、腦水腫和CVS的影響，進一步研究了槲皮素對HIF-1的