硫辛酸胺在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：硫辛酸（α-lipoic acid LA）是常見含有巰基的抗氧化劑，其在蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage SAH）模型中的神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)被證實(shí)。硫辛酸胺(α-lipoic acid-plus LAP)是LA的衍生物，體外實(shí)驗(yàn)中，LAP通過螯合溶酶體內(nèi)鐵抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷這一觀點(diǎn)已經(jīng)證實(shí)。由于溶酶體內(nèi)特定的酸性環(huán)境，LAP（PKa=8.0）比LA（PKa=5.4）更容易地進(jìn)入溶酶體內(nèi)，且與溶酶體內(nèi)

2、自由鐵反應(yīng)，然而LAP的神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制還未完全闡述。因此，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)來評(píng)估LA，LAP兩者在SAH后早期腦損傷（early brain injury EBI）中神經(jīng)保護(hù)作用的差異，以及探討LAP產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)1：42只健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為7組，每組6只，假手術(shù)組，SAH+vehicle組，LA（100 mg/kg）組，LAP(50 mg/kg)組，LAP(100 mg

3、/kg)組，LAP(150 mg/kg)組和LAP(200 mg/kg)組。視交叉前池一次注入自體非肝素化動(dòng)脈血0.3 ml構(gòu)建SAH活體大鼠模型。LA，LAP均通過胃管給藥，首次給藥在注血后的4小時(shí)，后連續(xù)三天，每天給藥一次。72小時(shí)后大鼠處死冰鹽水灌注取腦，經(jīng)脫水，固定和包埋切片，進(jìn)一步行溶酶體膜蛋白-1（Lysosomal-associated membrane protein-1 LAMP-1)/神經(jīng)元特異性核蛋白（Neuron

4、-specific Nuclear Protein NeuN）和LAMP-1/膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP）免疫熒光共染來評(píng)估SAH后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的溶酶體數(shù)量及膜的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)2：90只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組18只，假手術(shù)組，SAH+vehicle組，LA（100 mg/kg）組，LAP(100 mg/kg)組和LAP(150 mg/kg)組。72小時(shí)后灌注取腦

5、，蛋白質(zhì)印跡（western-blot WB）和免疫熒光共染法分析腦組織中的組織蛋白酶B/D（Cathepsin B/D），凋亡蛋白-3（caspase-3），Bax，鐵蛋白（ferritin）和血紅素氧合酶-1（heme Oxygenase-1 HO-1）的表達(dá)情況。腦組織切片鐵染色評(píng)估鐵含量，干濕法測(cè)定水腫指數(shù)，伊文氏藍(lán)（evansblue EB）來評(píng)價(jià)出血后的血腦屏障（blood–brain barrier BBB）的通透性，末端

6、標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling TUNEL）染色測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，相關(guān)的試劑盒來測(cè)定新鮮腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)1：72小時(shí)后，通過比較各組之間的熒光強(qiáng)度，得出SAH組中LAMP-1在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較假手術(shù)組顯著減弱，與LA組相比，LAMP-1在LAP(100 mg/kg)組中熒光強(qiáng)

7、度最強(qiáng)；但在星型膠質(zhì)細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組，SAH組和干預(yù)組之間的熒光強(qiáng)度無明顯差異。因次，我們選擇LAP(100 mg/kg)，LAP(150 mg/kg)兩個(gè)劑量行第二部分的實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)2：72小時(shí)后，與假手術(shù)組相比，我們觀察到Cathepsin B/D，caspase-3，Bax，ferritin和HO-1在腦組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，LA，LAP不僅能顯著抑制上述蛋白的表達(dá)，同時(shí)大鼠神經(jīng)功能缺陷，腦水腫含量，血腦屏障通