HIF-1α、MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用及大共素干預的實驗研究.pdf

1、目的:
　　探討缺氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)在重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷(severeacutepancreatitis-associatedlunginjury，SAPALI)中的表達及作用，應用中藥單體大黃素干預脂多糖刺激的肺泡上皮細胞，觀察HIF-1α以及腫瘤壞死因子-α(tum

2、ornecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子的變化。用RNA干擾的方法對肺泡上皮細胞的HIF-1α進行基因沉默，繼續(xù)觀察大黃素干預的sh-HIF-1α細胞中上述因子的變化。本實驗旨在進一步揭示HIF-1α、MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用，探究其在肺泡-毛細血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病中的作用。同時探討中藥單體大黃素在脂多糖刺激的肺泡上皮細胞炎癥中所發(fā)揮

3、的作用，尋找治療肺損傷的藥物作用靶點，為臨床治療重癥急性胰腺炎肺損傷提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　實驗一:將SD大鼠隨機分為假手術組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）。假手術組僅行剖腹術，翻動胰腺。模型組采用膽胰管逆行注入5％脫氧膽酸鈉(1ml/kg)建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。各組動物在術后24h檢測PaO2、PaCO2以及血淀粉酶。應用ELISA方法檢測動物模型血清中HIF-1α、MMP-9

4、以及TNF-α的活性，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達強度，采用Western-blot方法檢測肺組織HIF-1α、MMP-9的表達，并觀察胰腺、肺組織的病理變化。
　　實驗二:將SD大鼠隨機分為假手術組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）、二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）小劑量治療組(2ME25mg/kg，n=10)和二甲氧基雌

5、二醇大劑量治療組（2ME215mg/kg，n=10）。假手術組僅行剖腹術，翻動胰腺。模型組和二甲氧基雌二醇治療組均采用膽胰管逆行注入5％脫氧膽酸鈉(1ml/kg)建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。二甲氧基雌二醇治療組于造模后1小時，分別向動物模型內(nèi)腹腔注射HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二醇5mg/kg，15mg/kg。各組動物在術后24h測PaO2、PaCO2、血淀粉酶、肺組織伊文思藍含量以及肺濕干比值。應用ELISA方法檢測動物模型血清

6、中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性。應用RT-PCR檢測肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達強度，采用Western-blot方法檢測肺組織HIF-1α、MMP-9表達，并觀察四組胰腺和肺組織病理變化。
　　實驗三:選用人肺上皮細胞系(A549)進行培養(yǎng)，用低（10μmol/L）、中(20μmol/L)和高（40μmol/L）三個濃度的大黃素孵育作用后，再用LPS(200ng/ml)進行刺激造模，建立模型。應用

7、MTT實驗對細胞活性進行測定。應用RT-PCR檢測各組中HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA的表達強度，采用Western-blot方法檢測上述因子的蛋白表達。大黃素孵育敲除HIF-1α的A549細胞系，用LPS刺激細胞，體外建立細胞損傷模型。應用ELISA檢測sh-HIF-1α和sh-control兩組中TNF-α、IL-6的活性，采用Western-blot方法檢測HIF-1α蛋白的表達。另檢測大黃素和或干擾HIF-1α條件下

8、LPS誘導的A549細胞系培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6的表達，尋找大黃素可能的作用機制。
　　結(jié)果:
　　SAP模型組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍含量以及血淀粉酶高于假手術組(P＜0.05)，而PaO2低于假手術組(P＜0.05)。SAP組HIF-1α、MMP-9mRNA和蛋白表達較假手術組顯著升高(P＜0.05)。SAP組肺組織和胰腺組織病理評分高于假手術組病理評分(P＜0.05)。應用HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二

9、醇干預后發(fā)現(xiàn)，干預治療組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍含量以及血淀粉酶較SAP組下降，而PaO2較SAP組升高(P＜0.05)，同時2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述指標下降，PaO2升高(P＜0.05)。ELISA方法檢測HIF-1α、MMP-9、TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2ME2治療組中上述因子的活性較SAP組下降（P＜0.05），同時2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述因子的活性下降

10、更明顯(P＜0.05)，但是MMP-9活性在SAP和二甲氧基雌二醇小劑量治療組中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2ME2治療組中HIF-1α、MMP-9mRNA表達較SAP組差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，2ME2治療組中HIF-1α蛋白較SAP組下調(diào)，且HIF-1α蛋白在2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組下降更明顯(P＜0.05)。MMP-9蛋白表達在2ME25mg/kg和S

11、AP組中差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組MMP-9蛋白明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2ME2治療組中的肺組織和胰腺組織的病理評分較SAP模型組明顯下降，同時2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組組織的病理評分下降更明顯(P＜0.05)。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素LPS刺激肺上皮細胞損傷模型組的細胞生長活性較正常組細胞生長活性明顯下降，應用大黃素治療

12、后發(fā)現(xiàn)，治療組中細胞的生長活性較模型組有所上升，并且上升程度呈劑量依賴性(P＜0.05)。LPS刺激組的HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA表達強度較正常組升高，應用大黃素治療后，上述因子的mRNA表達情況均下調(diào)，尤以大黃素(40μmol/L)組為甚(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的HIF-1α蛋白表達較正常組升高，ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的TNF-α、IL-6蛋白較正常組升高，應用大黃素干預

13、治療后，上述因子的蛋白表達明顯下調(diào)，且大黃素（40μmol/L）組為甚(P＜0.05)。同時，我們在大黃素處理的同時干擾HIF-1α的表達，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α的表達要明顯低于未處理組、HIF-1α-shRNA組及單純應用大黃素組(P＜0.05)，這些結(jié)果說明在抑制LPS誘導的A549炎癥介質(zhì)的釋放的過程中大黃素可能是通過HIF-1α起作用的，同時二者在抑制炎癥發(fā)生的過程中具有協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　SAP肺損傷模型

14、中，HIF-1α、MMP-9在肺組織中表達升高。HIF-1α抑制劑2ME2可以緩解重癥急性胰腺炎肺損傷動物模型中肺泡-毛細血管屏障紊亂和肺水腫的嚴重程度，HIF-1α和MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷時肺泡-毛細血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要的作用。另外，大劑量應用2ME2可以明顯下調(diào)MMP-9的表達，說明MMP-9與HIF-1α可能在一條炎癥通路上，并且受“炎癥開關”HIF-1α的調(diào)控。體外實驗表明在LPS處理的人肺上皮細胞