HIF-1α在缺氧-復氧性HK-2細胞損傷中作用及丹參干預研究.pdf

1、背景和目的：缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是1992年Semenza對經缺氧處理的Hep3B和HepG2細胞株的核提取物進行電泳位移分析時首先被發(fā)現(xiàn)的，是細胞在缺氧條件下產生的具有轉錄活性的核蛋白，能與靶基因結合，通過轉錄和轉錄后調控使機體對缺氧、缺血產生適應性反應。HIF-1的發(fā)現(xiàn)使人們對缺氧缺血狀態(tài)下機體各種應答反應機制的研究更加深入。近幾年，HIF-1在腎臟中的作用也逐漸受到人

2、們的關注。 腎臟對于缺氧是非常敏感的。腎臟缺氧缺血性損傷是圍產期窒息、肺炎、腎臟移植和腎臟手術等臨床共同面臨的問題。在缺氧、缺血狀態(tài)下可誘導HIF-1表達的增加，HIF-1能啟動下游基因表達上調，在促進糖酵解，有效利用氧，紅細胞增生及葡萄糖轉運體增加等方面，HIF-1參與了缺氧細胞的能量代謝及氧利用障礙發(fā)生機制，對腎臟細胞具有明確的保護效應。 腎小管上皮細胞及其腎小管周圍成纖維細胞不僅是構成腎小管間質結構的主要細胞，還是

3、腎臟病變的重要生物學基礎。由于腎損傷最早的部位即腎小管，腎小管上皮細胞不僅是缺氧/復氧時的靶細胞，還是造成損傷進展的主要參與者。本文在前期建立人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)缺氧/復氧的損傷模型基礎上，探討HIF-1α在腎臟缺氧/復氧性損傷中的表達規(guī)律，探討其表達的意義。 眾多實驗研究表明：中藥能較好地抗缺氧/復氧的損傷，具有良好的應用前景。其中，丹參是尤為受到廣泛關注的中藥。已有研究表明，丹參對缺氧/復氧性損傷具有顯著的保護作

4、用。我們在前期建立人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)缺氧/復氧的損傷模型基礎上，研究丹參對缺氧/復氧損傷的HK-2細胞中HIF-1α表達的影響，來探討丹參的保護作用與HIF-1α表達之間的關系。 方法： (1)以人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)為研究對象； (2)采用液體石蠟覆蓋法建立缺氧/復氧模型，其中丹參組在覆蓋石蠟的同時加入丹參注射液，丹參注射液(生藥濃度為1ml含丹參1g)終濃度選為已證實為最佳有效濃度0.

5、1％。 (3)實驗分為三個組：第一大組為正常對照組；第二大組為模型組；第三大組為丹參組。每組都包括H1h、H4h、H8h、H12h、H24h、H/R1h、H/R4h、H/R8h、H/R12h、H/R24h。 (4)檢測指標：用ABC酶染色免疫組化法測定HIF-1α的陽性率(％)，MTT法進行活細胞的計數(shù)，生化法檢測培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性； (5)統(tǒng)計學處

6、理：所有數(shù)值以均值±標準差(-x±S)表示，實驗組各時間點進行單因素方差分析，組間進行LSD檢驗。P<0.05為差異有顯著性。采用SPSS11.5軟件完成。 結果： (1)經免疫組化檢測，HIF-1α主要表達于細胞核。在三個實驗組之間均有顯著差異(P<0.05)。在對照組，HIF-1α有陽性表達，但陽性率低，在10.81±0.89％±17.67±1.99％之間(>5％)。對照組與模型組之間比較，差異有顯著性(P<0.05

7、)。在缺氧第1小時后，HIF-1α即有明顯增高，達37.78±1.07％，隨著缺氧時間的增加，陽性率也不斷升高，在缺氧24小時達最高峰(73.26±1.89％)，復氧后HIF-1α的表達仍在升高，直到復氧4小時達最高峰，陽性率為87.68±1.38％，隨后逐漸下降，在復氧后24小時達最低水平；組間各時間點差異具有顯著性(P<0.05)。與模型組相比，在丹參組，各個時間點的HIF-1α表達陽性率明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。

8、 (2)在三個實驗組之間及模型組和丹參組的各個時間點之間活細胞數(shù)量均有顯著差異(P<0.05)。與對照組比較，模型組活細胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性，(P<0.05)；并隨著缺氧時間的延長進一步降低，在缺氧24小時到達最低值。與模型組相比，丹參組活細胞數(shù)除在H1,H8,H24改變不明顯外，其余各時間點明顯增多，差異具有顯著性(P<0.05)。 (3)與對照組相比，模型組LDH活性升高(P<0.05)，并隨著缺氧時間的延長而

9、逐漸增高，最高值在缺氧24小時-復氧4小時，達(44.76±3.08)IU/L和(48.85±0.32)IU/L；與模型組相比，丹參組LDH活性下降，差異具有顯著性(P<0.05)。 結論： (1)在腎臟HK-2細胞的缺氧/復氧性損傷中，缺氧可快速導致HIF-1α的表達增加，隨著缺氧的延長而上升。HIF-1α的表達增加是機體的一種內源性保護機制。 (2)丹參使HIF-1α的表達下降，作用機制可能與丹參降低氧自由基