蛋白激酶C對炎性痛大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡以及相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的影響.pdf

1、目的：蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是由多個(gè)可被Ca2+激活的絲氨酸蛋白激酶和蘇氨酸蛋白激酶所組成超家族，存在于細(xì)胞漿內(nèi)，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。PKC存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多種組織中，在神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性等過程中發(fā)揮重要作用。在靜息情況下，PKC以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)有外界刺激存在時(shí)，PKC被激活移位（Translocation）于細(xì)胞膜上即膜轉(zhuǎn)位

2、，進(jìn)而發(fā)揮重要的生理功能。
　　 以往的研究證實(shí)，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)PKC活化；我室的研究還證實(shí)，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡。有關(guān)PKC激活在脊髓傷害性信息傳遞及痛覺過敏方面的作用已有一些報(bào)道，但PKC是否參與甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元凋亡過程尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 Bax蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。Bax蛋白存在于細(xì)胞漿中，廣泛分布于機(jī)體各組織，無明顯的組織特異性。如果

3、甲醛炎性痛引起PKC活性改變參與傷害性信息傳入引起的脊髓神經(jīng)元凋亡過程，其是否通過影響B(tài)ax蛋白表達(dá)而影響神經(jīng)元凋亡尚有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)首先采用流式細(xì)胞技術(shù)，觀察預(yù)先鞘內(nèi)注射PKC抑制劑燈盞花素乙（Chelerythrine chloride，CH）對甲醛炎性痛大鼠L4-5脊髓節(jié)段神經(jīng)元凋亡率的影響，并觀察了正常大鼠鞘內(nèi)給予PKC激動(dòng)劑佛波醇酯（Phorbol12-Myrstate-Acetate，PM

4、A）對脊髓神經(jīng)元凋亡率的影響，探討PKC在甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡中的作用。在此基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)方法，觀察了甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓后角神經(jīng)元內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的改變，并通過鞘內(nèi)注射PKC激動(dòng)劑及抑制劑，觀察PKC對大鼠脊髓后角神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的影響，探討PKC參與甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。
　　 1.PKC對甲醛炎性痛大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡的影響
　　 25只健康雄性Sprague

5、-Dawley大鼠，體重280±20克，隨機(jī)分為5組，分別為正常對照組（control組），甲醛組（F組）、甲醛+鞘內(nèi)注射溶劑DMSO組（F+DMSO組），甲醛+鞘內(nèi)注射PKC抑制劑CH組（F+CH組），正常大鼠鞘內(nèi)注射PKC激動(dòng)劑佛波醇酯組（PMA組），每組5只動(dòng)物。Control組不做任何處理，直接斷頭取材。F組于大鼠右側(cè)足底注射甲醛后，3d時(shí)斷頭取材；F+DMSO組和F+CH組大鼠預(yù)先鞘內(nèi)注射10μlDMSO或CH溶液，15分鐘后

6、于右側(cè)足底注射甲醛，于甲醛注射后3d時(shí)取材。PMA組于正常大鼠鞘內(nèi)注射10μl PMA后，于鞘內(nèi)注射PMA后3d時(shí)取材。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測脊髓神經(jīng)元的凋亡率。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常大鼠鞘內(nèi)注射PMA后，動(dòng)物出現(xiàn)煩躁不安，搔抓盒底、舔咬物品和自發(fā)退縮等傷害性感受行為，表明鞘內(nèi)注射PMA可誘導(dǎo)正常大鼠產(chǎn)生自發(fā)痛反應(yīng)。
　　 流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，control組大鼠L4-5脊髓神經(jīng)元凋亡率很低。與control組相比，

7、F組大鼠L4-5脊髓神經(jīng)元凋亡率明顯增高（P<0.01）；與F組相比，F(xiàn)+DMSO組脊髓神經(jīng)元凋亡率無顯著性差異，表明鞘內(nèi)注射溶劑DMSO對脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯影響。與F組相比，F(xiàn)+CH組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率明顯降低（P<0.01）。與control組相比，PMA組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率則表現(xiàn)為明顯升高（P<0.01）。
　　 以上結(jié)果表明，PKC可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元凋亡，在甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡過程中，PKC起促進(jìn)神

8、經(jīng)元凋亡的作用。
　　 2.甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓后角神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)改變及其PKC對Bax蛋白表達(dá)的影響
　　 2.1甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓后角神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)改變
　　 25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重280±20克，隨機(jī)分為5組，分別為正常對照組（control組）、甲醛12h組（F12h組）、甲醛1d組（F1d組）、甲醛2d組（F2d組）、甲醛3d組（F3d組），每

9、組5只動(dòng)物。Control組不做任何處理，直接斷頭取材。甲醛各組動(dòng)物均于足底注射甲醛后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取L4-5脊髓節(jié)段，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層神經(jīng)元Bax蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠右后足底注射甲醛后，立即出現(xiàn)舔、搖、和自發(fā)性縮足等自發(fā)痛行為，且注射部位出現(xiàn)紅、腫等明顯的炎癥反應(yīng)，表明動(dòng)物出現(xiàn)了炎性痛。
　　 免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，control組大鼠L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax免疫

10、反應(yīng)陽性細(xì)胞面積較小，細(xì)胞染色較淺。與control組相比，足底注射甲醛后12h，大鼠兩側(cè)脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積有所增大（P<0.01），但陽性細(xì)胞平均光密度值增加不明顯（P>0.05），表明Bax表達(dá)已有所增加；足底注射甲醛1d時(shí)，大鼠脊髓后角Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積進(jìn)一步增大（P<0.01），達(dá)到峰值，免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞平均光密度值也明顯增加（P<0.01），表明細(xì)胞染色也明顯加深；與F1d組比較，F(xiàn)2d組大鼠

11、脊髓后角Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積以及陽性細(xì)胞染色深度均開始下降，但均高于control組水平（P<0.01）；F3d組大鼠Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積仍高于control組水平（P<0.01），但陽性細(xì)胞平均光密度值已接近正常對照組水平（P>0.05）。同組動(dòng)物左右兩側(cè)脊髓后角相比，Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積以及陽性細(xì)胞染色深度均無明顯差異。
　　 以上結(jié)果表明，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)兩側(cè)脊髓后角神經(jīng)元Bax蛋白表達(dá)增加，于注射甲醛后

12、1d時(shí)達(dá)到高峰。
　　 2.2 PKC對甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bax的影響
　　 25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重280±20克，隨機(jī)分為5組，分別為正常對照組（control組）、甲醛組（F組）、甲醛+鞘內(nèi)注射溶劑DMSO組（F+DMSO組），甲醛+鞘內(nèi)注射PKC抑制劑CH組（F+CH組），正常大鼠鞘內(nèi)注射PKC激動(dòng)劑佛波醇酯組（PMA組），每組5只動(dòng)物。Control組不做任何

13、處理，直接斷頭取材。F組于大鼠右側(cè)足底注射甲醛后1d時(shí)斷頭取材；F+DMSO組和F+CH組大鼠預(yù)先鞘內(nèi)注射10μlDMSO或CH溶液，15分鐘后于右側(cè)足底注射甲醛，于注射甲醛后1d取材。PMA組于正常大鼠鞘內(nèi)注射10μlPMA后，于鞘內(nèi)注射PMA后1d取材。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax蛋白的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與control組比較，F(xiàn)組大鼠L4-5節(jié)段脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax蛋白表達(dá)明顯

14、增加，表現(xiàn)為Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積增大（P<0.01），免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞染色加深，平均光密度值升高（P<0.01）。與F組比較，F(xiàn)+DMSO組大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積及平均光密度值均無顯著性差異（P>0.05），表明鞘內(nèi)注射溶劑DMSO對炎性痛大鼠脊髓后角Bax蛋白表達(dá)無明顯影響。與F組比較，F(xiàn)+CH組大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積明顯減少，陽性細(xì)胞染色明顯變淺（P<0.01）。與contr

15、ol組相比，PMA組大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞面積以及平均光密度值均明顯增加（P<0.01）。
　　 以上結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射PKC的抑制劑CH可抑制傷害性信息傳入誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元Bax蛋白的表達(dá)；鞘內(nèi)注射PKC的激動(dòng)劑PMA可促進(jìn)脊髓神經(jīng)元Bax蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究結(jié)果證實(shí)，PKC抑制劑可抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡過程，PKC激活可促進(jìn)正常大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡。