Dicer酶對(duì)巨噬細(xì)胞功能極化的影響.pdf

1、研究目的：觀察巨噬細(xì)胞在M1，M2不同功能極化狀態(tài)下Dicer酶的表達(dá)情況；構(gòu)建針對(duì)Dicer酶的干擾載體，建立Dicer酶表達(dá)抑制的巨噬細(xì)胞株；檢測(cè)Dicer酶表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞功能和M1、M2功能極化的改變，明確小分子RNA合成通路障礙對(duì)巨噬細(xì)胞功能極化的影響。
　　 研究方法：(1)通過(guò)Real time PCR和Western blot檢測(cè)原代骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞系RAW264.7在M1、M2不同功能

2、狀態(tài)下Dicer酶的表達(dá)情況。(2)將Dicer基因mRNA作為RNA干擾的靶區(qū)，設(shè)計(jì)特異的Dicer-siRNA干擾序列，插入含U6和H1雙啟動(dòng)子的慢病毒載體Double-promoter pFIV-H1/U6 siRNAExpression vector中，構(gòu)建成抑制Dicer基因表達(dá)的RNA干擾表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7中，通過(guò)Real time PCR和Western blot觀察干擾載體對(duì)Dicer酶表達(dá)的

3、抑制效果；通過(guò)microRNA real time PCR檢測(cè)對(duì)mir-155、mir-223的抑制效果；通過(guò)CCK8檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；通過(guò)凋亡試劑盒檢測(cè)對(duì)細(xì)胞死亡凋亡的影響；通過(guò)Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移功能；通過(guò)FITC-dextran吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。(3)通過(guò)Real time PCR和體外細(xì)胞殺菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制Dicer酶表達(dá)后巨噬細(xì)胞M1\M2功能狀態(tài)的變化。
　　 研究結(jié)果：(1)Dicer

4、酶在巨噬細(xì)胞M1功能狀態(tài)下表達(dá)降低，耐受時(shí)表達(dá)升高；在巨噬細(xì)胞M2功能狀態(tài)下表達(dá)增高。(2)成功構(gòu)建Dicer-siRNA慢病毒表達(dá)載體及篩選出有效干擾Dicer酶表達(dá)的穩(wěn)定巨噬細(xì)胞株；CCK8及凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)Dicer酶受抑制后，細(xì)胞增殖未受影響，凋亡/死亡率有所增高；遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dicer酶表達(dá)受抑后細(xì)胞遷移能力沒(méi)有明顯改變；吞噬實(shí)驗(yàn)證明Dicer酶抑制未影響細(xì)胞的吞噬活力。(3)Dicer酶表達(dá)下調(diào)抑制了巨噬細(xì)胞向M2功能方向極