雙酚A對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化影響的體外研究.pdf

1、研究背景：人工合成化學(xué)物雙酚A（Bisphenol A，BPA）已經(jīng)成為世界上最高產(chǎn)量的化學(xué)物之一。主要用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的生產(chǎn)。聚碳酸酯塑料廣泛用于飲料容器和食品包裝袋的生產(chǎn)。環(huán)氧樹脂主要用于食品罐頭的食物接觸面。在加熱及堿性或者酸性環(huán)境下，BPA單體會(huì)從這些包裝容器里釋放出來(lái)進(jìn)入到環(huán)境和食物中。人們?cè)谑秤眠@些容器包裝的食物時(shí)，會(huì)攝入BPA。生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，超過(guò)90％的人暴露于BPA，在他們的血液和尿液中都可以檢測(cè)到BPA或

2、其代謝產(chǎn)物。BPA是一種已知的環(huán)境內(nèi)分泌干擾化學(xué)物（environmental endocrine disrupting chemical，EDC），具有弱雌激素活性，可以對(duì)包括內(nèi)分泌、神經(jīng)行為、生殖發(fā)育等產(chǎn)生不良影響。
　　大量的研究表明，BPA暴露與肥胖以及肥胖相關(guān)的胰島素抵抗具有明顯的相關(guān)，而肥胖是機(jī)體處于一種全身低度的慢性炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為脂肪組織中大量脂肪組織巨噬細(xì)胞（adipose tissue macrophages，

3、ATMs）浸潤(rùn)。在肥胖發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，浸潤(rùn)在內(nèi)臟脂肪組織的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，損害脂肪細(xì)胞分泌有益的脂肪因子和儲(chǔ)存脂質(zhì)的功能。巨噬細(xì)胞在脂肪組織的聚集和浸潤(rùn)與其極化狀態(tài)明顯相關(guān)。巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活的發(fā)揮促炎作用的 M1型（F4/80+CD11c+CD206-）和替代活化的發(fā)揮抗炎作用的M2型（F4/80+CD11c-CD206+）。然而，BPA對(duì)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)的影響，至今也尚未見(jiàn)報(bào)道。但這對(duì)研究BPA引起胰島素抵抗的作用機(jī)

4、制非常有意義。
　　研究目的：通過(guò)分析不同濃度BPA對(duì)體外誘導(dǎo)極化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞亞型（M1和M2型）表面分子、分泌的細(xì)胞因子、調(diào)控巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)錄因子IRF-4和IRF-5的影響，探討B(tài)PA對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞極化的影響，為BPA誘導(dǎo)肥胖等代謝紊亂發(fā)病機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：SPF級(jí)健康6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠。斷頭法處死小鼠，無(wú)菌條件下向腹部注入含雙抗（100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素

5、）的DMEM培養(yǎng)基5 ml，用注射器抽取腹腔液約4 ml，常溫下1000r·min-1離心8 min，棄上清。調(diào)整細(xì)胞至所需濃度，接種于6孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h。PBS洗去未貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞正常培養(yǎng)24h后，用10ng/mL的IFN-γ和500 ng/mL的LPS誘導(dǎo)其向M1型極化，用10ng/mL的 IL-4誘導(dǎo)其向M2型極化。在加入誘導(dǎo)劑的同時(shí)用0.1、1和10μmol/L的BPA處理細(xì)胞，用DMSO作溶劑對(duì)照

6、。誘導(dǎo)向M1型極化時(shí)，先用10 ng/mL的IFN-γ誘導(dǎo)24h，再加入500 ng/mL的LPS刺激細(xì)胞24h，然后收集上清和細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)M1型和M2型巨噬細(xì)胞比例。ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子IL-6，iNOS，MCP-1，IL-10，和Arg-1的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-quantitative polymerase chain reaction

7、，RT-qPCR）檢測(cè)IL-6，iNOS，MCP-1，CD11c，IL-10，Arg-1，CD206，IRF4，IRF5的基因表達(dá)水平。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)極化結(jié)果
　　1.1、誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)變化
　　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈圓形（M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)），用M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣（M2

8、型巨噬細(xì)胞形態(tài)）。
　　1.2、誘導(dǎo)前后M1型和M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化
　　FCM檢測(cè) M1型巨噬細(xì)胞的比例較誘導(dǎo)前升高2.50倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；M2型巨噬細(xì)胞的比例升高2.33倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　1.3、誘導(dǎo)前后M1型和M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的變化
　　ELISA檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子iNOS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），M2型巨噬細(xì)胞

9、分泌的細(xì)胞因子Arg-1明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2、不同劑量BPA對(duì)體外誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化的影響
　　2.1、對(duì)M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M1比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1和10μmol/L BPA組的M1比例升高（P<0.05，P<0.01）。
　　2.2、對(duì)M1型巨噬細(xì)胞表面分子CD11c mRNA表達(dá)水平的

10、影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的CD11cmRNA表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1μmol/LBPA組和10μmol/LBPA的CD11c表達(dá)水平明顯升高（P<0.01，P<0.01）
　　2.3、對(duì)M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響
　　2.3.1、對(duì)M1巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量或活性的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M1型巨噬細(xì)胞分

11、泌的促炎性細(xì)胞因子IL-6，iNOS，MCP-1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1和10μmol/L BPA組IL-6，iNOS，MCP-1表達(dá)升高（P<0.01，P<0.01）
　　2.3.2、對(duì)M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M1型巨噬細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子IL-6，iNOS，MCP-1mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1μmol/L BPA組和

12、10μmol/L BPA組IL-6，iNOS，MCP-1mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比，顯著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。
　　3、不同劑量BPA對(duì)體外誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M2型極化的影響
　　3.1、對(duì)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M2比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1和10μmol/L BPA組的M2比例下降（P<0.05，P<0.01）。<

13、br>　　3.2、對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表面分子CD206 mRNA表達(dá)水平的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M2型巨噬細(xì)胞表面分子CD206mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1和10μmol/L BPA組的CD206 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。
　　3.3、對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響
　　3.3.1、對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量或活性的影響<

14、br>　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的M2型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎性細(xì)胞因子IL-10和Arg-1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1μmol/L BPA組和10μmol/L BPA組IL-10和Arg-1表達(dá)下降（P<0.01，P<0.01）。
　　3.3.2、對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響
　　與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎性細(xì)胞因子I

15、L-10和Arg-1mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1μmol/L BPA組IL-10和Arg-1mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），10μmol/L BPA組IL-10和Arg-1 mRNA表達(dá)也顯著降低（P<0.05，P<0.05）。
　　4、BPA對(duì)體外誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化中IRF4和IRF5 mRNA水平的影響
　　4.1、BPA對(duì)體外誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化中IRF4和IRF5 mRNA水平

16、的影響
　　M1型極化中：各劑量BPA組的轉(zhuǎn)錄因子IRF4 mRNA表達(dá)水平差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組和0.1μmol/L BPA組的IRF5的mRNA表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1μmol/L BPA組和10μmol/L BPA組IRF5 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.01，P<0.01）。
　　M2型極化中：與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組，0.1μmol/L BPA組和1μmol/L BPA組

17、IRF4的mRNA表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而10μmol/L BPA組IRF4表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）；各劑量BPA組的轉(zhuǎn)錄因子IRF5 mRNA表達(dá)水平差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.2、轉(zhuǎn)錄因子IRF4和IRF5與巨噬細(xì)胞亞型比例的相關(guān)性
　　相關(guān)性分析顯示，轉(zhuǎn)錄因子IRF5與M1型巨噬細(xì)胞有顯著正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r=0.629，P=0.012）。
　　結(jié)論：
　　1、體外條件下，IFN-γ能夠誘

18、導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化；IL-4能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。
　　2、體外條件下，低濃度的BPA能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化，增加M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，升高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞特異性表面分子CD11c的mRNA的表達(dá)，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-6，iNOS，MCP-1的表達(dá)。
　　3、體外條件下，低濃度的BPA抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M2型極化，減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，降低M2型巨噬細(xì)胞特異性表面分子CD20