LOx-1及細(xì)胞外HSP60在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷中作用的研究.pdf

1、第一部分 LOX-1在小膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷中作用的研究
　　機(jī)體的免疫應(yīng)答是一把“雙刃劍”，小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥參與眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病理進(jìn)程。除外源性病原相關(guān)分子模式（PAMP）外，損傷組織細(xì)胞自身釋放的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)也具有免疫調(diào)節(jié)作用。
　　本研究采用反復(fù)凍融法構(gòu)建神經(jīng)元損傷細(xì)胞模型，收集損傷神經(jīng)元條件培養(yǎng)基作為可溶性DAMP分子混合物;以此條件培養(yǎng)基處理大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，評(píng)

2、估可溶性DAMP分子的炎癥刺激作用;利用體外神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，分析可溶性DAMP分子的神經(jīng)毒性。我們發(fā)現(xiàn):在初始損傷因素已去除情況下，損傷神經(jīng)元釋放的可溶性DAMP自身即可有效活化小膠質(zhì)細(xì)胞，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、一氧化氮(NO)、活性氧簇(ROS)，造成繼發(fā)性神經(jīng)損傷，形成“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)。
　　凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)屬C-型凝集素樣

3、受體家族及清道夫受體家族，可介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥，參與動(dòng)脈粥樣硬化等病理進(jìn)程，在CNS內(nèi)功能不明。本研究以LPS刺激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，采用RT-PCR及Western blot法證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)LOX-1蛋白，其表達(dá)水平受LPS刺激而上調(diào)。為探討LOX-1在DAMP介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷進(jìn)程中的作用，我們以RNA干擾技術(shù)下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)LOX-1表達(dá)，重復(fù)上述小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn):下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)LOX-1表達(dá)，可減

4、弱由DAMP引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少由DAMP引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、NO及ROS等炎性介質(zhì)的釋放，減輕由DAMP引發(fā)、小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的繼發(fā)性神經(jīng)損傷。
　　綜上所述，本研究明確了LOX-1為小膠質(zhì)細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體;在神經(jīng)損傷進(jìn)程中，LOX-1通過識(shí)別損傷神經(jīng)元釋放的可溶性DAMP，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，加重神經(jīng)損傷，參與“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)。
　　第二部分細(xì)胞外

5、HSP60通過小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體LOX-1參與“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)
　　小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)參與眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)退行性疾病病理進(jìn)程;然而迄今為止，推動(dòng)該循環(huán)的分子機(jī)制尚未完全闡明。
　　熱休克蛋白60(HSP60)是一類高度保守且廣泛表達(dá)的分子伴侶蛋白，主要參與調(diào)控蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位及降解。除細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶功能外，HSP60在某些應(yīng)激情況下可被釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮免疫調(diào)

6、節(jié)作用。細(xì)胞外HSP60在CNS內(nèi)的功能尚不明了。本研究采用反復(fù)凍融法模擬神經(jīng)元損傷，以Western blot法證實(shí)損傷神經(jīng)細(xì)胞可向外界釋放可溶性HSP60。為分析細(xì)胞外HSP60在CNS內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用，我們采用文獻(xiàn)報(bào)道的真核過表達(dá)系統(tǒng)制備細(xì)胞外HSP60，并以此刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞外HSP60在CNS內(nèi)發(fā)揮損傷相關(guān)分子模式（DAMP）樣作用，可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因

7、子IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄、一氧化氮(NO)的釋放、活性氧簇（ROS）的生成，造成繼發(fā)性神經(jīng)損傷。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)為HSP60受體，可直接識(shí)別結(jié)合HSP60并促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對(duì)于HSP60偶聯(lián)抗原的交叉提呈。第一部分結(jié)果顯示，LOX-1為小膠質(zhì)細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，參與DAMP觸發(fā)的“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)。為探討細(xì)胞外HSP60與LOX-1的相互作用在神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損

8、傷進(jìn)程中的意義，我們以RNA干擾技術(shù)下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)LOX-1表達(dá)，重復(fù)上述小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)LOX-1表達(dá)，可減弱由細(xì)胞外HSP60引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)（IL-1β、NO及ROS等）合成釋放，減輕細(xì)胞外HSP60引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的繼發(fā)性神經(jīng)損傷。
　　綜上所述，損傷神經(jīng)細(xì)胞可釋放可溶性HSP60;細(xì)胞外HSP60在CNS內(nèi)發(fā)揮DMAP樣作用;細(xì)胞外HSP60通過刺激小膠質(zhì)細(xì)胞表面模式

9、識(shí)別受體LOX-1，活化小膠質(zhì)細(xì)胞，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥，加重神經(jīng)損傷，推動(dòng)“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)。
　　第三部分 DAMP與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)（綜述）
　　進(jìn)行性、不可逆性神經(jīng)損傷為眾多神經(jīng)退行性疾病的共同病理特征，在初始損傷因素已去除的情況下，神經(jīng)損傷仍可持續(xù)存在，分子機(jī)制不明。小膠質(zhì)細(xì)胞為常駐中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central neural system，CNS)的巨噬細(xì)胞樣固有免疫細(xì)胞?！办o息”

10、狀態(tài)及適度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)揮重要的免疫防御、免疫監(jiān)視作用，維持CNS內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。過度或者持續(xù)性活化的小膠質(zhì)細(xì)胞則介導(dǎo)神經(jīng)炎癥，釋放包括IL-1β、TNF-α、一氧化氮及活性氧簇等在內(nèi)的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)損傷。大量數(shù)據(jù)證實(shí):小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)性活化介導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性病理進(jìn)程中扮演著重要的角色。然而，究竟何種機(jī)制維持了這種小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)性活化，尚未完全明了。最近的研究表明，除細(xì)菌脂多糖等外源性病原相關(guān)分子模式(patho

11、gen-associated molecular pattern，PAMP)外，損傷神經(jīng)細(xì)胞釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)——損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)亦可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)CNS炎癥反應(yīng)。本文介紹了目前已知的與神經(jīng)炎癥相關(guān)的主要DAMP分子，分析了DAMP在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的“神經(jīng)炎癥-神經(jīng)損傷”惡性循環(huán)中可能的作用，旨在以DAMP為切入點(diǎn)探討慢性神經(jīng)炎癥、持續(xù)性神經(jīng)損傷