小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的興奮性氨基酸在大鼠DA1神經(jīng)損傷中的作用.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷（DAI）是指頭部遭受鈍性特殊外力，產(chǎn)生加速運(yùn)動(dòng)時(shí)，在剪應(yīng)力的作用下，腦內(nèi)發(fā)生的以神經(jīng)軸索腫脹、斷裂為特征的一系列的病理生理變化，可單獨(dú)出現(xiàn)也可伴隨其他病理改變。典型的表現(xiàn)為意識(shí)障礙，臨床診斷較困難且預(yù)后差。已有研究表明，DAI造成外傷后的腦功能障礙不僅是由于最初的機(jī)械外力等作用所致的原發(fā)性損傷，很大程度上與損傷后發(fā)生的復(fù)雜的神經(jīng)元“二次打擊”（神經(jīng)元繼發(fā)性損傷）有關(guān)。
　　 前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)觀察到大量的小膠質(zhì)細(xì)

2、胞在DAI后被激活，且小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及呼吸爆發(fā)在DAI后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用。但是神經(jīng)損傷的機(jī)制不僅限于直接的細(xì)胞因子的作用，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的毒性作用更為重要。研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不僅起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性氨基酸代謝的重要場(chǎng)所，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可釋放大量的興奮性氨基酸，同時(shí)興奮性氨基酸也可進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞。而興奮性氨基酸過(guò)多產(chǎn)生的興奮毒性作用在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可以導(dǎo)致神經(jīng)損

3、傷，包括炎癥、缺血及神經(jīng)退行性變。而小膠質(zhì)細(xì)胞在DAI模型中介導(dǎo)的興奮性氨基酸在神經(jīng)損傷中的作用尚不明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在參照1994年[5]MarmarouA等的方法建立大鼠DAI模型，并給予小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抑制劑米諾環(huán)素進(jìn)行治療，采用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，觀察DAI后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分布特點(diǎn)及米諾環(huán)素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用。并通過(guò)高效液相色譜對(duì)腦組織中的興奮性氨基酸進(jìn)行定量分析，觀察DAI后興奮

4、性氨基酸的變化及米諾環(huán)素對(duì)興奮性氨基酸變化的影響，探討興奮性氨基酸的促損傷作用。以期為法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案工作中對(duì)DAI損傷的客觀評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，并為臨床治療提供新思路。
　　 方法：Sprague-Dawley大鼠（體重：260±28g）隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、損傷組、治療組；每組包括9個(gè)不同時(shí)相：0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d。參照MarmarousA等的方法制備大鼠腦DAI模型。
　　 假

5、手術(shù)組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理，但不予打擊；損傷組和治療組給予打擊；打擊后治療組腹腔注射米諾環(huán)素(45mg/kg)，之后每天一次，直至動(dòng)物被處死。損傷組在與治療組相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射同劑量的生理鹽水。根據(jù)打擊后按不同時(shí)間給予10％水合氯醛麻醉后取全腦，制作石蠟切片，采用HE染色觀察大鼠腦組織的病理改變。用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定腦組織中皮層及腦干損傷區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)狀況。用高效液相色譜法測(cè)定腦組織中興奮性氨基酸的含量變化。
　　

6、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組小膠質(zhì)細(xì)胞灰密度值及興奮性氨基酸各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，以p＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立彌漫性軸索損傷模型：常規(guī)HE染色觀察，損傷后12h組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元變性水腫明顯，部分神經(jīng)元壞死，大量小膠質(zhì)細(xì)胞增生伴嗜神經(jīng)現(xiàn)象；損傷后24-48h組織損傷加重。72h逐漸好轉(zhuǎn)。而治療組各時(shí)

7、段與損傷組相比，組織疏松程度較輕，小膠質(zhì)細(xì)胞增生較少，水腫不明顯。
　　 2、CD11b免疫組化結(jié)果的觀察：損傷組6h時(shí)CD11b染色較淺，數(shù)量較少；打擊后12h小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加突起變粗、變短，胞體增大、變圓。皮層CD11b的表達(dá)在打擊后12h達(dá)到高峰，腦干CD11b的表達(dá)在打擊后24h達(dá)到高峰；之后逐漸減少；72h仍可見(jiàn)。治療組與損傷組小膠質(zhì)細(xì)胞的激活趨勢(shì)相同，但數(shù)量及形態(tài)上有一定差異。治療組表達(dá)在6h前與損傷組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)差異。12h、24h、48h、72h與損傷組有明顯差異。
　　 3、高效液相色譜對(duì)谷氨酸及天門(mén)冬氨酸的測(cè)定：各組腦組織測(cè)定結(jié)果：與假手術(shù)組相比，損傷組皮層腦組織在損傷后谷氨酸及天門(mén)冬氨酸即有明顯升高，12h到達(dá)高峰，之后逐漸下降，7d后基本恢復(fù)正常。而治療組與損傷組趨勢(shì)相同，12h-72h均低于損傷組，72h己基本恢復(fù)正常。
　　 損傷組腦干組織在損傷后谷氨酸和天門(mén)冬氨酸即明顯高于正常，24h達(dá)到高峰，之后逐漸下降，7

9、d后基本恢復(fù)正常。而治療組與損傷組趨勢(shì)相同，12h-72h均低于損傷組，72h已基本恢復(fù)正常水平。
　　 結(jié)論：采用MarmarouA的自由落體撞擊模型復(fù)制了大鼠DAI模型，觀察到DAI后米諾環(huán)素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，且大鼠皮層及腦干谷氨酸及天門(mén)冬氨酸的含量與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在時(shí)空上相關(guān)。米諾環(huán)素可以通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用降低腦組織中谷氨酸及天門(mén)冬氨酸的含量；在一定程度上說(shuō)明興奮性氨基酸與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切相關(guān)。小膠