小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Regnase-1負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)損傷.pdf

1、以神經(jīng)炎癥的調(diào)控為切入點進(jìn)行相關(guān)研究有助于加深對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病病理過程的理解，同時也有益于發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病的新治療靶點。危險相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)的出現(xiàn)作為組織和細(xì)胞受損的信號被認(rèn)為是一種警報素，預(yù)警著損傷發(fā)生的同時又進(jìn)一步介導(dǎo)一系列無菌性炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，從而在適應(yīng)性免疫和固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。高遷移率蛋白B-1（high mobility group

2、-1 protein，HMGB1）是DAMPs中的重要一員，正常情況下大部分HMGB1作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)有病原體的刺激或者組織的損傷出現(xiàn)時，HMGB1將會被主動或者被動的釋放至胞外，進(jìn)而與免疫細(xì)胞表面相應(yīng)的模式識別受體結(jié)合啟動細(xì)胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。
　　調(diào)節(jié)性RNA酶-1（regulatory RNase-1，Regnase-1），又名Zc3h12a或者單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)

3、蛋白(monocytechemotactic protein-induced protein，MCPIP)，是一個具有內(nèi)切酶活性的CCCH型鋅指蛋白。Regnase-1可以通過特異性識別炎癥因子mRNA3'端非編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)降來解炎癥因子的mRNA，這些炎癥因子包括括白介素(interleukin,IL)-1β/2/6/12β，干擾素-γ(interferon-γ,IF-γ)等。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotac

4、tic protein1，MCP-1），脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和IL-1β被證實可以通過NF-κB或MAPK信號通路引起Regnase-1的有效轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。
　　本研究將以中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的炎癥細(xì)胞之一——小膠質(zhì)細(xì)胞做為研究對象，通過一些列實驗探究HMGB1是否能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Regnase-1的表達(dá)增加，并通過功能缺失的實驗方法研究Regnase-1是否對HMGB1介導(dǎo)的炎癥具有負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng);

5、最后，通過探究HMGB1刺激下Regnase-1對神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用去評價Regnase-1在神經(jīng)炎癥損傷過程中對神經(jīng)組織的保護(hù)潛力。
　　研究目的：
　　1.明確HMGB1刺激下BV2細(xì)胞（小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株）炎癥因子的表達(dá)變化情況。
　　2.明確HMGB1的刺激是否誘導(dǎo)Regnase-1在BV-2細(xì)胞中表達(dá)增加。
　　3.明確HMGB1的刺激是否誘導(dǎo)Regnase-1在大鼠腦內(nèi)表達(dá)增加，并明確其表達(dá)與小膠質(zhì)

6、細(xì)胞的共定位情況。
　　4.在HMGB1刺激下，Regnase-1的敲低是否使BV-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步增加并加重HMGB1誘導(dǎo)的炎癥對神經(jīng)元的毒性損傷作用。
　　研究方法
　　1.檢測HMGB1刺激下，BV-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化
　　2.檢測HMGB1刺激下，BV-2細(xì)胞Regnase-1的表達(dá)變化
　　3.檢測HMGB1刺激大鼠鼠腦后Regnase-1在腦內(nèi)的表達(dá)情況
　　分別向Wist

7、ar大鼠右側(cè)側(cè)腦室注射HMGB1(8μ g/kg)或生理鹽水（對照組），24小時后麻醉大鼠，用PBS進(jìn)行心臟灌注。
　　(1)取出腦組織，分別提取兩組大鼠腦蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡(Westernblot)，檢測并對比兩組大鼠腦內(nèi)Regnase-1蛋白的表達(dá)。
　　(2)使用4％甲醛灌注固定鼠腦，取出腦組織使用不同濃度蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片，采用免疫組化觀察兩組大鼠鼠腦Regnase-1的表達(dá)，采用免疫熒光檢測Regnase-1

8、與小膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況。
　　4.HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞，檢測細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的表達(dá)變化
　　將Regnase-1特異性siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞（si-Zc3h12a組），錯義序列siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞作為陰性對照（siControl組）。轉(zhuǎn)染后使用相同濃度的HMGB1(1μg/ml)刺激BV-2細(xì)胞1小時，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行qPCR特異性擴(kuò)增Regnase-1以及炎癥因子IL-

9、1β、IL-6、TNF-α的cDNA，和對照組進(jìn)行對比顯示Regnase-1和炎癥因子的表達(dá)變化。采用Western blot和酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV2細(xì)胞后，Il-1β蛋白的表達(dá)和分泌變化。
　　5.HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞，檢測其上清對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性
　　實驗分為兩

10、組，si-Zc3h12a組（敲低Regnase-1組）及si-Control組（對照組），兩組BV-2細(xì)胞完成轉(zhuǎn)染后，用HMGB1(1μ g/ml)刺激細(xì)胞1小時，收集細(xì)胞上清。將細(xì)胞上清與SH-SY5Y細(xì)胞（神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株）共孵育8，12或24小時后，采用CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit，CCK-8）檢測SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性，并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài);采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色后在流式

11、細(xì)胞儀上檢測SH-SY5Y細(xì)胞的死亡率。
　　6.統(tǒng)計分析
　　本研究全部數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗分析;多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用Turkey法，當(dāng)方差不齊時采用Dunnett' T3法;兩因素比較時采用two-way ANOVA，方差齊時采用Turkey法，當(dāng)方差不齊時采用Dunnett' T3法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　

12、　結(jié)果:
　　1.不同濃度的HMGB1(0.1，0.5和1μ g/ml)刺激BV-2細(xì)胞24小時，IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均升高，且呈劑量依賴性。HMGB1(1μ g/ml)刺激BV-2細(xì)胞不同時間（0、4、12和24小時），4小時后IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)至高峰，且直至24小時仍有表達(dá)升高;TNF-α mRNA水平的升高表現(xiàn)為雙向模式。
　　2.不同濃度的HMGB1(0.1，0.5和1μg/ml)刺激

13、BV-2細(xì)胞24小時，Reganse-1的表達(dá)升高，且呈劑量依賴性。HMGB1(1μ g/ml)刺激BV-2細(xì)胞不同時間（0、4、12和24小時），4小時后Regnase-1的mRNA表達(dá)至高峰，且直至24小時仍有表達(dá)升高。
　　3.Western blot和免疫組化的結(jié)果表明，側(cè)腦室注射HMGB1組的大鼠鼠腦較對照組的Regnase-1蛋白表達(dá)增多。免疫熒光顯示HMGB1刺激后，大鼠腦內(nèi)表達(dá)增多的Regnase-1與小膠質(zhì)細(xì)胞存

14、在共定位。
　　4.qPCR結(jié)果顯示敲低Regnase-1后，HMGB1刺激BV-2細(xì)胞1小時，IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)較未敲低組表達(dá)增高（P＜0.05）。Western blot和ELISA結(jié)果顯示敲低Regnase-1后，HMGB1刺激BV-2細(xì)胞1小時，IL-1β的蛋白表達(dá)和分泌較未敲低組增高。
　　5.HMGB1刺激敲低或未敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞后收集細(xì)胞上清，然后將細(xì)胞上清與SH-SY5Y細(xì)

15、胞共孵育8、12或24小時，CCK-8實驗結(jié)果和光學(xué)顯微鏡下的觀察均顯示，對比未敲低組，敲低Regnase-1后的細(xì)胞上清孵育SH-SY5Y細(xì)胞12小時后細(xì)胞活性更低（P＜0.05）。AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測顯示，對比未敲低組，敲低Regnase-1后的細(xì)胞上清孵育SH-SY5Y細(xì)胞12小時后細(xì)胞死亡率更高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.本研究通過體外實驗證明了HMGB1誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞株B

16、V-2細(xì)胞的Regnase-1表達(dá)增加，同時在體內(nèi)實驗中驗證了HMGB1誘導(dǎo)Regnase-1表達(dá)增加且與小膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位，可為HMGB1介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)疾病的研究提供研究基礎(chǔ)。
　　2.Regnase-1負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1刺激下BV-2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2細(xì)胞后，IL-1β、IL-6表達(dá)進(jìn)一步增加，證明了小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Regnase-1參與負(fù)性調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的神