神經(jīng)膠質(zhì)瘤外泌體介導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的作用研究.pdf

1、侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)標(biāo)志，也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。高度侵襲性是惡性膠質(zhì)瘤的重要病理學(xué)特征，瘤體邊界不清致使手術(shù)完整切除難度增大，從而導(dǎo)致腫瘤很快復(fù)發(fā)，這是患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率、死亡率高的主要原因。腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，國(guó)內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的35％～60％，5年生存率僅為20％～30％，是神經(jīng)外科臨床工作中面臨的最嚴(yán)重的腫瘤之一。對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療措施，傳統(tǒng)上仍然以手術(shù)為最重要的手段，但由于膠

2、質(zhì)瘤多為浸潤(rùn)型生長(zhǎng)，單純的手術(shù)治療后，很容易復(fù)發(fā)，療效并不能使人滿(mǎn)意。由于腫瘤細(xì)胞存在放療抗拒，術(shù)后放療尚不能殺滅殘余的腫瘤細(xì)胞，因此研究腫瘤細(xì)胞是通過(guò)怎樣的機(jī)制逃避放療的殺傷和如何降低此種機(jī)制的作用，對(duì)提高放療在膠質(zhì)瘤治療中的療效有很大的必要性。
　　腫瘤細(xì)胞的免疫逃避是指其通過(guò)多種方式逃避機(jī)體的免疫識(shí)別和攻擊，例如:細(xì)胞表面標(biāo)志物的改變，包括腫瘤細(xì)胞表面的MHCⅠ類(lèi)分子表達(dá)下降或者缺失、腫瘤抗原的變異、FAS系統(tǒng)的作用、B7分

3、子的表達(dá)異常等。腫瘤來(lái)源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等，其可以影響DC細(xì)胞及T細(xì)胞的成熟活化。腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙，其中主要是通過(guò)受體/配體結(jié)合的方式釋放抑制性的信號(hào)，降低T細(xì)胞的功能。T細(xì)胞功能的障礙，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫減弱。
　　PIGF在癌變的情況下會(huì)引起高表達(dá)，同時(shí)它的相關(guān)受體VEGFR1的表達(dá)也會(huì)提高。PIGF在多種腫瘤中明顯上升，可以作為某些癌癥的指標(biāo)性物質(zhì)。PIGF不僅可以刺激血管源細(xì)胞形成

4、新血管，而且PIGF可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，損傷DC細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，也可以刺激骨髓中血管生成祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移向腫瘤病灶。加入PIGF抗體在體內(nèi)不僅可以阻止新血管的生成，還可以刺激己生成血管的退化。最近研究報(bào)道顯示PIGF也參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　我們假設(shè)膠質(zhì)瘤分泌的PIGF通過(guò)外泌體作用于膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中的B細(xì)胞，使B細(xì)胞能夠表達(dá)TGF-β，轉(zhuǎn)化為T(mén)GF-β(+)的Bregs細(xì)胞，Bregs細(xì)胞可以特異性

5、的抑制膠質(zhì)瘤患者CD8(+)T細(xì)胞的增殖和活性，從而膠質(zhì)瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視向正常組織侵襲擴(kuò)散。
　　通過(guò)本研究證明:
　　1、從膠質(zhì)瘤組織中分離純化的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞（WHOⅢ～Ⅳ級(jí)）在體外培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)PIGF mRNA和蛋白有表達(dá)，當(dāng)用不同濃度的PMA刺激后PIGF隨其濃度增加而增加。表明惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有PIGF表達(dá)。
　　2、密度梯度離心分離膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清中的外泌體，LAMP-1特異性驗(yàn)證外泌體后，裂解外泌體后可

6、檢測(cè)出P1GF蛋白，表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以表達(dá)PIGF，并且其外泌體中也含有P1GF蛋白
　　3、正常人全血中分離獲得Na(i)ve B細(xì)胞(CD19+ IL-7R+ CD45+)，將收集的膠質(zhì)瘤外泌體用CSFE標(biāo)記后與Naive B細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Naive B細(xì)胞可以捕獲膠質(zhì)瘤外泌體;進(jìn)一步將捕獲膠質(zhì)瘤外泌體的Naive B細(xì)胞，用單價(jià)PIGF和其抑制劑的Naive B細(xì)胞為對(duì)照，結(jié)果顯示:不同濃

7、度外泌體刺激的B細(xì)胞隨外泌體濃度的升高TGF-β mRNA和蛋白都增高，單加PIGF也可使Naive B細(xì)胞表達(dá)TGF-β增加。表明攜帶PIGF的膠質(zhì)瘤外泌體可以被Naive B細(xì)胞捕獲，捕獲后的Naive B細(xì)胞可特異表達(dá)TGF-β，且與PIGF調(diào)控有關(guān);即攜帶PIGF的外泌體可以將膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中NaiveB細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)GF-β(+)Bregs細(xì)胞。
　　4、將膠質(zhì)瘤組織中分離的B細(xì)胞、膠質(zhì)瘤患者外周血中的B細(xì)胞以及刺激轉(zhuǎn)化

8、的TGF-β(+)Bregs細(xì)胞分別用CSFE標(biāo)記，提取膠質(zhì)瘤組織內(nèi)含物，10mg/ml的膠質(zhì)瘤組織提取物分別刺激三種獲得的B細(xì)胞，以10mg/ml BSA為陰性對(duì)照，5％ CO237℃孵箱培養(yǎng)3天后流式檢測(cè)三種B細(xì)胞增殖程度，結(jié)果表明:91.2％的組織來(lái)源B細(xì)胞增殖和8.14％的外周血B細(xì)胞增殖，約有60.8％的Bregs細(xì)胞得到增殖，結(jié)果顯示增殖的B細(xì)胞具有膠質(zhì)瘤特異性，膠質(zhì)瘤特異性Bregs細(xì)胞可能存在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤患者的外周

9、循環(huán)系統(tǒng)中
　　5、 從膠質(zhì)瘤患者全血中密度梯度離心分離PBMC后，接種75cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h后，將貼壁細(xì)胞與非貼壁細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)，加入不同細(xì)胞刺激因子培養(yǎng)7天獲得DC細(xì)胞和T細(xì)胞，再采用磁珠法分離純化CD8(+) CD25(-)T細(xì)胞。
　　將獲得的CD8(+) CD25(-)T細(xì)胞用CSFE標(biāo)記后，按30萬(wàn):20萬(wàn)比例與DC細(xì)胞混合接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，10mg/ml膠質(zhì)瘤組織提取物，陰性對(duì)照加入10mg/ml

10、BSA，然后加入20萬(wàn)誘導(dǎo)Bregs細(xì)胞、Naive B細(xì)胞以及誘導(dǎo)Bregs細(xì)胞先與膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)后刺激3天，不加B細(xì)胞為對(duì)照。結(jié)果顯示:，流式細(xì)胞結(jié)果以CSFE標(biāo)記細(xì)胞設(shè)門(mén)，BSA刺激的CD8+T細(xì)胞增殖2.18％，膠質(zhì)瘤提取物刺激的CD8+T細(xì)胞增殖23.0％，提示其中有一部分為膠質(zhì)瘤特異性CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增;膠質(zhì)瘤特異性CD8+T細(xì)胞可被膠質(zhì)瘤特異性誘導(dǎo)Bregs細(xì)胞抑制活性，CD8+T細(xì)胞增殖為2.11％，天然B細(xì)胞則不能抑

11、制CD8+T細(xì)胞增殖為30.2％。誘導(dǎo)Bregs細(xì)胞與T/DC細(xì)胞相同條件分開(kāi)培養(yǎng)后再混合也可以抑制，CD8+T細(xì)胞增殖3.33％。膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)刺激膠質(zhì)瘤患者CD8+T細(xì)胞可以分泌顆粒酶B和穿孔素，當(dāng)Bregs細(xì)胞存在時(shí)也可以抑制其分泌。表明攜帶PIGF外泌體誘導(dǎo)的TGF-β(+)Bregs細(xì)胞具有特異性抑制膠質(zhì)瘤CD8(+)T細(xì)胞增殖，同時(shí)穿孔素與顆粒酶B檢測(cè)結(jié)果顯示Bregs細(xì)胞也可抑制CD8(+)T細(xì)胞的殺傷活性。