衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞Wnt-β-catenin信號(hào)介導(dǎo)的外周神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛的研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 外周神經(jīng)的損傷及炎癥往往導(dǎo)致中樞痛覺過敏，并嚴(yán)重威脅著人類健康和生活質(zhì)量。然而，現(xiàn)有鎮(zhèn)痛藥物和治療手段均不能有效解決，臨床上稱為神經(jīng)病理性疼痛。近期研究表明，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制不僅涉及神經(jīng)損傷，還包括毒性興奮性刺激以及神經(jīng)免疫功能失調(diào)。除了神經(jīng)元以外，神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞也參與了神經(jīng)病理性疼痛的形成。這些細(xì)胞的激活將介導(dǎo)各種神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子以及炎癥因子的釋放。因此，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成了功能調(diào)

2、控的網(wǎng)絡(luò)。而神經(jīng)病理性疼痛也被科學(xué)家看作為神經(jīng)系統(tǒng)的免疫功能失調(diào)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)發(fā)育的Wnt/β-catenin通路也可能介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。Wnt蛋白家族是神經(jīng)系統(tǒng)的重要分泌蛋白，在神經(jīng)發(fā)育中對(duì)細(xì)胞增殖與分化起關(guān)鍵作用。Wnt信號(hào)通路將直接介導(dǎo)下游分子參與基因轉(zhuǎn)錄和分子粘附。β-catenin又稱β連環(huán)蛋白，是胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄輔助因子。它被認(rèn)為在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生過程中扮演關(guān)鍵角色

3、。β-catenin入核后可以結(jié)合T cellfactor/lymphoid enhancer factor(TCF/LEF)啟動(dòng)下游多種蛋白的表達(dá)。然而β-catenin在胞內(nèi)被GSK3β、APC、Axin等分子結(jié)合形成降解復(fù)合物，從而在胞內(nèi)濃度相對(duì)穩(wěn)定而不啟動(dòng)入核功能。凡是能影響其降解復(fù)合物形成的改變（如阻斷GSK3β、APC、Axin功能）都能影響胞漿內(nèi)β-catenin的濃度和入核功能。文獻(xiàn)報(bào)道稱，β-catenin是影響軸突再

4、生和髓鞘化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔助因子。同時(shí)也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)腫瘤和免疫細(xì)胞內(nèi)β-catenin可調(diào)控炎癥及疼痛相關(guān)因子的表達(dá)，如connexin43，NADPH氧化酶，COX2，MMP-2，TNF-α等。Wnt/β-catenin通路在多種疼痛模型中的表達(dá)變化已經(jīng)被報(bào)道，但其表達(dá)的變化究竟是一種伴隨現(xiàn)象還是介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵因素尚不明確。另外Wnt/β-catenin通路在外周神經(jīng)的致痛作用尤其是DRG神經(jīng)元的作用機(jī)制尚待闡明。
　　

5、 本研究中，我們檢測(cè)了四種Wnt蛋白家族的代表分子以及β-catenin在大鼠SNL造模后7天的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種Wnt蛋白Wnt1、Wnt4、Wnt3a、 Wnt5a的表達(dá)在傷側(cè)神經(jīng)元減少，而β-catenin主要表達(dá)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞，且在傷側(cè)DRG顯著降低。衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞由縫隙連接相連，包繞感覺神經(jīng)元形成細(xì)胞環(huán)，由此構(gòu)成了一個(gè)感覺神經(jīng)元的微環(huán)境。它可以分泌多種炎癥和細(xì)胞因子影響神經(jīng)元的興奮性。我們進(jìn)一步通過鞘內(nèi)緩慢注射Wnt激動(dòng)劑t

6、hiophene pyrimidine derivative有效緩解了SNL大鼠的痛敏癥狀并增加了衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)。由此我們推測(cè)，Wnt/β-catenin通路在SNL術(shù)后DRG表達(dá)降低不僅僅是一種伴隨現(xiàn)象，它可能通過神經(jīng)元和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞之間的交互作用介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛。
　　 綜上所述，鑒于Wnt/β-catenin通路在神經(jīng)病理性疼痛中的潛在研究?jī)r(jià)值，本課題通過在體SNL模型和鞘內(nèi)注射Wnt激動(dòng)劑研究該激動(dòng)

7、劑對(duì)大鼠機(jī)械痛覺及衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響。并通過體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞，給予Wnt激動(dòng)劑以及慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA影響β-catenin的胞內(nèi)表達(dá)量，檢測(cè)下游疼痛相關(guān)分子iNOS和COX2的表達(dá)變化，旨在探索Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DRG水平介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制，也期望為開發(fā)更有效的止痛藥物提供有效靶點(diǎn)，具有理論和臨床意義。
　　 [研究方法]
　　 1.大鼠SNL模

8、型，檢測(cè)術(shù)后機(jī)械痛覺閾值和術(shù)后DRG Wnt/β-catenin通路表達(dá)變化
　　 制作SNL造模，并檢測(cè)術(shù)后痛覺閾值變化。取造模成功大鼠術(shù)后7天傷側(cè)和健側(cè)DRG，通過real-time PCR檢測(cè)傷側(cè)和健側(cè)神經(jīng)組織Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a的表達(dá)變化。通過Western blot技術(shù)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Wnt1和β-catenin蛋白在傷側(cè)和健側(cè)神經(jīng)組織的表達(dá)變化，并通過免疫組織化學(xué)確定其蛋白的表達(dá)定位。

9、　　 2.SNL模型合并鞘內(nèi)置管術(shù)，造模后7天，鞘內(nèi)緩慢注射Wnt激動(dòng)劑并檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛覺閾值變化和術(shù)后DRG中β-catenin的表達(dá)變化
　　 SNL造模同時(shí)行鞘內(nèi)置管術(shù)，在SNL造模成功后第七天痛閾穩(wěn)定時(shí)鞘內(nèi)緩慢注射Wnt激動(dòng)劑，同時(shí)檢測(cè)注射藥物注射后不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾值。分組:1、SNL+Wntagonist(50μM)(n=8);2、SNL+Wnt agonist(10μM)(n=8);3、SNL+Wnt ag

10、onist(1μM)(n=8);4、SNL+Veh(n=8);5、Sham+Wnt agonist(50μM)(n=8);6、Sham+Veh(n=8),在注射藥物后第8小時(shí)處死大鼠，取出給藥組和溶劑對(duì)照組大鼠傷側(cè)和健側(cè)DRG，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)給藥組和溶劑對(duì)照組β-catenin的蛋白表達(dá)變化。通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)β-catenin蛋白在給藥組和溶劑對(duì)照組的表達(dá)變化。
　　 3.慢病毒介導(dǎo)β-catenin

11、shRNA特異性干預(yù)體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞并檢測(cè)β-catenin、iNOS和COX2的表達(dá)
　　 體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞，分兩組:空病毒組(NC組)和敲減病毒組(KD組)，分別在培養(yǎng)基加入空病毒和慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA3天后，三天后裂解細(xì)胞，通過real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)空病毒組(NC組)、敲減病毒組(KD組)β-catenin、iNOS和COX2的表達(dá)。
　　 4.Wn

12、t激動(dòng)劑干預(yù)體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞并檢測(cè)β-catenin和COX2表達(dá)
　　 體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞，分三組:對(duì)照組、12小時(shí)組、24小時(shí)組，在培養(yǎng)基加入Wnt agonist(3μM)，在不同時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞，通過real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)β-catenin和COX2的表達(dá)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以X±SED表示。兩組間比較采用

13、T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），行為學(xué)數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA:重復(fù)測(cè)量方差分析和holm-sidak檢驗(yàn)，P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.SNL術(shù)后Wnt在傷側(cè)神經(jīng)元表達(dá)降低
　　 SNL造模后7天取傷側(cè)和健側(cè)DRG，通過real-time PCR檢測(cè)傷側(cè)和健側(cè)神經(jīng)組織Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a的基因表達(dá)變化。結(jié)果

14、發(fā)現(xiàn)四種蛋白的基因表達(dá)水平傷側(cè)遠(yuǎn)低于健側(cè)。(SNL/CON，Wnt1:17.2±5.21％; Wnt3a:17.9±5.18％;Wnt5a:16.9±7.91％; Wnt4:57.1±8.94％, each group，n=3，*P＜0.05，**P＜0.01)通過Western blot技術(shù)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Wnt1蛋白在傷側(cè)和健側(cè)神經(jīng)組織的表達(dá)變化。(SNL vs.CON，Wnt1:0.42±0.04 vs.1.12±0.12，n=

15、3，**P＜0.05)免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt1主要表達(dá)于NeuN(+)神經(jīng)元，而Western blot結(jié)果提示W(wǎng)nt1蛋白表達(dá)傷側(cè)低于健側(cè)。以上結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(SNL:損傷側(cè)，CON:對(duì)照側(cè))
　　 2.SNL術(shù)后傷側(cè)β-catenin表達(dá)在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)降低
　　 SNL造模后1、3、7、14天取傷側(cè)和健側(cè)DRG，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)傷側(cè)和健測(cè)神經(jīng)組織β-catenin的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果

16、發(fā)現(xiàn)傷側(cè)β-catenin的蛋白表達(dá)較健側(cè)逐漸降低。(SNL vs.CON，7d:0.18±0.03 vs.0.34±0.03;14d:0.14±0.02 vs.0.35±0.05，n=4，*P＜0.05)通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)β-catenin蛋白在術(shù)后14天傷側(cè)和健側(cè)神經(jīng)組織的表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin主要表達(dá)于S100(+)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 3.鞘內(nèi)緩慢注射Wnt激動(dòng)劑有效緩解了SNL大鼠的痛敏癥狀

17、并增加了衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin的表達(dá)
　　 SNL造模同時(shí)行鞘內(nèi)置管術(shù)，在SNL造模后第七天痛閾穩(wěn)定時(shí)鞘內(nèi)緩慢注射Wnt激動(dòng)劑，同時(shí)檢測(cè)注射后不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾。結(jié)果提示藥物注射后4-10小時(shí)50μM組較溶劑對(duì)照組痛覺閾值提高最明顯。(Wnt agonist+SNL vs Veh+SNL，*P＜0.05，**P＜0.01).在注射藥物后第8小時(shí)處死大鼠，取出給藥組和溶劑對(duì)照組大鼠傷側(cè)和健側(cè)DRG，通過Western bl

18、ot技術(shù)檢給藥組和溶劑對(duì)照組β-catenin的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于結(jié)扎側(cè)DRG，給Wnt agonist較溶劑對(duì)照組有效升高β-catenin的蛋白表達(dá)(Wnt agonist vs Veh:0.39±0.04 vs.0.24±0.03，n=4，*P＜0.05)。
　　 4.慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA特異性降低體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)并增加iNOS和COX2表達(dá)
　　 衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞

19、培養(yǎng)基加入慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA3天后，裂解細(xì)胞，通過real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)空病毒組(NC組)、敲減病毒組（KD組）β-catenin、iNOS和COX2的表達(dá)。結(jié)果顯示慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA可有效降低β-catenin表達(dá)，基因水平(β-catenin mRNA: KD/NC:28±8％，n=3，*P＜0.05)和蛋白水平（KD vs.NC，0.31±0.04

20、vs.0.52±0.04，n=3，*P＜0.05）表達(dá)均增加。
　　 同時(shí)，慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA增加iNOS和COX2的表達(dá)?；蛩?COX2mRNA: KD/NC:187±30.7％; iNOS mRNA: KD/NC:1260±136％;n=3,*P＜0.05,**P＜0.01）和蛋白水平(COX2: KD vs.NC，1.12±0.13 vs.0.77±0.1;KD vs.NC，0.32±0.02 v

21、s.0.15±0.01，n=3，*P＜0.05)表達(dá)均增加。
　　 5.Wnt激動(dòng)劑增加體外培養(yǎng)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)并減少COX2表達(dá)。
　　 衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基加入wnt激動(dòng)劑的12及24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，通過real-timePCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組（CON組）、12小時(shí)組和24小時(shí)組β-catenin和COX2的表達(dá)。結(jié)果顯示W(wǎng)nt激動(dòng)劑在12小時(shí)有效增加β-catenin蛋白表

22、達(dá)(β-catenin:12h vs CON:1.08±0.09 vs0.53±0.03，n=3，**P＜0.01)。而Wnt agonist加入12和24小時(shí)后，都能減少COX2蛋白水平的表達(dá)(12h vs CON:0.53±0.06 vs.0.74±0.04;24h vs.CON:0.3±0.04 vs.0.74±0.04, n=3，*P＜0.05,**P＜0.01)，加入Wnt agonist12h組其COX2基因水平的表達(dá)也減少

23、(COX2: Wnt agonist/CON:43.6±4.62％，n=3，*P＜0.05)。
　　 [研究結(jié)論]
　　 慢病毒介導(dǎo)β-catenin shRNA可降低衛(wèi)星膠質(zhì)胞內(nèi)β-catenin，而β-catenin表達(dá)降低可導(dǎo)致疼痛相關(guān)分子iNOS和COX2的表達(dá)。由Wnt激動(dòng)劑激活Wnt/β-catenin通路可增加β-catenin同時(shí)降低COX2的表達(dá)。在大體上SNL模型術(shù)后Wnt蛋白在神經(jīng)元上表達(dá)降低，而導(dǎo)