環(huán)氧合酶抑制劑塞來昔布對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞促血管新生作用及其血管生成素-2表達(dá)的影響.pdf

1、腫瘤是典型的血管依賴性病變，腫瘤的惡性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管新生。腫瘤血管新生是在多種因素的嚴(yán)密調(diào)控下進(jìn)行的，是促進(jìn)血管新生因素和抑制血管新生因素間失衡的結(jié)果。新生的腫瘤血管增加腫瘤的血液灌注，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。目前以腫瘤血管新生為靶點(diǎn)的治療已成為腫瘤治療研究領(lǐng)域的主要方向之一。 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。血管生成

2、素-2(angiopoietin-2，-Ang-2)可特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管生成及維持血管平衡中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可抑制腫瘤生長(zhǎng)，增加腫瘤組織壞死。但其對(duì)腫瘤細(xì)胞中血管生成素-2表達(dá)的影響國(guó)內(nèi)尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，應(yīng)用Matrigel建立血管形成的體外培養(yǎng)體系，來研究塞來昔布

3、對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成及腫瘤細(xì)胞中血管生成素表達(dá)的影響，進(jìn)而探討塞來昔布與腫瘤血管新生的關(guān)系及其作用機(jī)制。 方法： 采用改進(jìn)的Jaffe氏培養(yǎng)法進(jìn)行HUVECs培養(yǎng)，應(yīng)用Matrigel誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu)，建立血管形成的體外培養(yǎng)體系，然后施加實(shí)驗(yàn)因素。體外分離培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)后，制備腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液。以二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)為溶劑將塞來昔布制成20μ

4、m/l、40μm/l、60μm/l三種濃度試劑。實(shí)驗(yàn)分兩部分，第一部分觀察HUVECs在Matrigel上形成管腔結(jié)構(gòu)的情況。分三組，第一組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(無血清DMEM培養(yǎng)液)和不同濃度的腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用組(腫瘤細(xì)胞上清液與DMEM培養(yǎng)液比分別為1：2、1：1、2：1)，作用24小時(shí)。第二組為塞來昔布濃度效應(yīng)組(20μm/l、401μm/l、60μm/l)對(duì)照組加入二甲基亞砜。第三組為塞來昔布時(shí)間效應(yīng)組(12h、24h、48h)

5、對(duì)照組加入二甲基亞砜。第二部分檢測(cè)Ang-2蛋白的表達(dá)，同樣分塞來昔布濃度效應(yīng)組和塞來昔布時(shí)間效應(yīng)組。各試驗(yàn)組用倒置相差顯微鏡觀察、照相，然后用95％冰乙醇固定，進(jìn)行GFAP和Ang-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色。采用光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)管腔數(shù)及計(jì)算機(jī)圖像分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。 結(jié)果： 腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于培養(yǎng)的HUVECs后，培養(yǎng)體系的管腔數(shù)增多。塞來昔布作用后培養(yǎng)體系的管腔數(shù)減少，且在一定范圍內(nèi)呈劑量和

6、時(shí)間依賴效應(yīng)(P<0.01)；隨培養(yǎng)體系的管腔數(shù)減少，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ang-2表達(dá)減少，且在一定范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)(P<0.01)。 討論： 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和腫瘤促進(jìn)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，在炎癥和腫瘤組織中過表達(dá)。COX-2存在增殖性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中，能促進(jìn)腫瘤血管新生和腫瘤生長(zhǎng)，因此選擇性COX-2抑制劑對(duì)惡性實(shí)體瘤的治療是一種有前景的治療方法

7、。但COX-2抑制劑對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用以前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要目的是明確選擇性COX-2抑制劑對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的血管新生及Ang-2表達(dá)的影響。 腫瘤的血管新生是受血管新生因子和血管新生抑制因子的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)，腫瘤的血管新生因子主要來源于腫瘤細(xì)胞，由腫瘤細(xì)胞釋放，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促其增生形成新生血管。本實(shí)驗(yàn)觀察到腫瘤條件培養(yǎng)液作用于培養(yǎng)的HUVECs后培養(yǎng)體系的管腔數(shù)增多，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。推測(cè)腫瘤細(xì)胞可通過

8、分泌某些促血管新生因子促進(jìn)腫瘤血管新生。我們?cè)谂囵B(yǎng)體系中加入不同濃度的塞來昔布溶液及用其作用不同時(shí)間，治療組與對(duì)照組相比管腔數(shù)明顯減少且在一定范圍內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)。 Ang-2是血管生成素(angiogenin)家族中的一員。腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下分泌較多的VEGF和Ang-2，并使Ang-2在VEGF的協(xié)同作用下，促進(jìn)腫瘤壞死組織周圍新生血管的形成。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到治療組與對(duì)照組相比Ang-2的表達(dá)明顯減少且在一定范圍

9、內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)。提示塞來昔布作為一種選擇性COX-2抑制劑可通過COX-2依賴途徑在蛋白水平上抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌Ang-2，從而抑制腫瘤血管新生。 結(jié)論： 1、腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)Matrigel體外誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成，并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。 2、塞來昔布可以抑制人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞促血管新生作用，并在一定范圍內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)。 3、塞來昔布可以下調(diào)人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Ang-2表達(dá)