環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用.pdf

1、本課題從病理形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實驗動物學(xué)的角度，通過免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)等方法，研究了選擇性COX-2抑制劑塞來昔布(Celccoxib)對人舌鱗狀細(xì)胞癌(Humantonguesquamouscellcarcinoma，HTSCC)Tca8113細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。首先采用免疫組化的方法研究了人正?？谇徽衬?、不典型增生上皮、舌鱗狀細(xì)胞癌及有、無癌轉(zhuǎn)移的頸部淋巴結(jié)組織中COX-2、血管內(nèi)皮生長因子-C(Va

2、scularendothelialgrowthfactor-C，VEGF-C)的表達(dá)及舌癌組織中的微血管密度(MicrovesselDensity，MVD)，探討COX-2和VEGF-C蛋白在HTSCC組織中的表達(dá)強度與臨床診斷及預(yù)后分析中的相互關(guān)系及意義；運用分子生物學(xué)方法觀察塞來昔布抑制Tca8113細(xì)胞生長及誘導(dǎo)凋亡的作用，研究塞來昔布增強抗癌藥物順鉑(Cisplatin，CDDP)及博萊霉素(Bleomycin，BLM)對Tca

3、8113細(xì)胞的殺傷作用；建立裸鼠Tca8113細(xì)胞皮下移植瘤動物模型，觀察塞來昔布與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后對裸鼠移植瘤的生長抑制作用，探討選擇性COX-2抑制劑在口腔癌預(yù)防及治療方面的應(yīng)用價值。 一、COX-2和VEGF-C在人舌鱗癌組織中的表達(dá)及與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 目的：通過觀察COX-2及VEGF-C在人正?？谇火つぁ⒉坏湫驮錾掀?、舌癌以及有、無癌轉(zhuǎn)移的頸部淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，研究兩者與舌癌發(fā)生、血管生成及頸部淋巴結(jié)

4、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。 方法：搜集2000年至2006年間我院病理科保存的46例舌鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本，其中男性26例，女性20例，年齡28～81歲，平均(53.78±11.43)歲。標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實，均為高～中分化鱗狀細(xì)胞癌。 根據(jù)免疫染色情況，通過計數(shù)的方法，計算CDa4標(biāo)記的微血管數(shù)量，研究腫瘤組織中微血管密度(MVD)。 結(jié)果：COX-2在人正常口腔粘膜上皮不表達(dá)或弱表達(dá)，在增生和不典型增生的鱗狀上皮中表達(dá)逐漸增

5、強，在大部分舌鱗癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達(dá)。 結(jié)論：COX-2與VEGF-C的強陽性表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，COX-2和/或VEGF-C可以作為臨床判斷腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移潛能及估計預(yù)后重要的參考指標(biāo)，其在腫瘤發(fā)生中的作用機制有待于進(jìn)一步探討。 二、COX-2抑制劑塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用 目的：觀察選擇性COX-2抑制劑塞萊昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞生長抑

6、制及誘導(dǎo)凋亡的作用。 方法：Tca8113細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，分別加入含有不同濃度塞來昔布的培養(yǎng)液，并以塞來昔布敏感細(xì)胞人肝癌Hep-G2細(xì)胞株作為陽性對照，其藥物終濃度分別為2.5、5、10、20、40、80μmol/L。培養(yǎng)24、48、72h后，采用MTT方法測定細(xì)胞的OD值，計算細(xì)胞生長抑制率；采用倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察藥物處理后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化；采用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期變化；應(yīng)用熒光顯微鏡

7、觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；應(yīng)用ArmexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞早期凋亡的變化。 結(jié)果：COX-2蛋白在Tca8113細(xì)胞呈強陽性表達(dá)，塞來昔布在抑制細(xì)胞生長的同時，抑制Tca8113細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)。塞來昔布主要以劑量依賴方式抑制Tca8113細(xì)胞的生長、增殖，當(dāng)藥物濃度達(dá)到≥40μmol/L時，這種作用最為明顯。 結(jié)論：COX-2抑制劑塞來昔布主要以劑量依賴的方式，通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)凋亡

8、的作用抑制Tca8113細(xì)胞生長、增殖，其作用機制有待進(jìn)一步研究。 三、COX-2抑制劑塞來昔布增強抗癌藥物對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的殺傷作用 目的：研究COX-2抑制劑塞來昔布與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用后能否增強抗癌藥物對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的殺傷作用。 方法：本研究采用塞來昔布(10μmol/L)分別與CDDP(3.12、6.25、12.5mg/L)和BLM(3.12、12.5、50mg/L)聯(lián)合作用Tca

9、8113細(xì)胞。培養(yǎng)24、48、72h后，MTT測定聯(lián)合用藥對Tca8113細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，經(jīng)S-N-K法統(tǒng)計學(xué)檢驗后，再用金正鈞法計算q值，判斷塞來昔布與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用后對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用，當(dāng)q=1±0.15為相加作用，q>1.15為協(xié)同作用，q<0.85為拮抗作用。同時采用流式細(xì)胞儀檢測聯(lián)合用藥后對Tca8113細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，光鏡下觀察聯(lián)合用藥后Tca8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：塞來昔布與CDDP

10、及BLM聯(lián)合應(yīng)用后，可顯著增強CDDP及BLM阻滯Tca8113細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，其阻滯G1期細(xì)胞進(jìn)入S期的作用最為明顯，導(dǎo)致G0/G1細(xì)胞的數(shù)量增加，S期及G2/M期細(xì)胞減少。G0/G1期細(xì)胞數(shù)量從抗癌藥單用時的(58.53±1.00)％增加至(61.83±0.50)％(CDDP，P=0.001)，及從(56.5±0.96)％增加至(60.93±0.32)％(BLM，P=0.000)，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，S期細(xì)胞數(shù)量從(3

11、1.3±0.70)％減少至(29.63±0.64)％(CDDP，P=0.175)和(30.3±1.95)％減少至(30.57±0.78)％(BLM，P=0.849)，G2/M期細(xì)胞也隨G0/G1期和S期細(xì)胞數(shù)量的變化而發(fā)生相應(yīng)改變。 結(jié)論：小劑量的塞來昔布即可增強CDDP及BLM對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用，抑制細(xì)胞生長與增殖，增強對細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯作用，其與CDDP和BLM聯(lián)合應(yīng)用后對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用呈協(xié)同作用

12、或相加作用。 四、動物體內(nèi)觀察COX-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合順鉑的抗癌作用 目的：進(jìn)一步研究COX-2抑制劑塞來昔布單獨應(yīng)用或與抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用對Tca8113細(xì)胞裸鼠荷瘤的生長抑制作用。 方法：將Tca8113細(xì)胞(2×106個細(xì)胞)接種于32只Balb/c裸鼠皮下，一周后，確認(rèn)裸鼠皮下種植部位已成瘤后，將裸鼠隨機分為4組：對照組、塞來昔布組、CDDP組及塞來昔布+CDDP聯(lián)合用藥組，每組8只。塞來昔布組采用灌胃給

13、藥，劑量為200mg/kg·d-1；CDDP組采用腹腔注射給藥，劑量為5mg/kg·w-1。塞來昔布+CDDP組采用塞來昔布(200mg/kg·d-1，灌胃)+CDDP(5mg/kg·w-1，腹腔注射)；對照組予腹腔注射生理鹽水，口服滅菌蒸餾水。給藥后每隔7天測量移植瘤的直徑并計算體積。給藥后35天處死裸鼠，測移植瘤質(zhì)量，計算抑瘤率。光鏡及電鏡觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；免疫組織化學(xué)檢測移植瘤組織COX-2、VEGF-C

14、蛋白的表達(dá)；熒光定量PCR檢測各組移植瘤組織中COX-2、VEGF-CmRNA的表達(dá)，并通過析因方差分析檢驗塞來昔布和CDDP兩藥對裸鼠移植瘤生長、移植瘤組織中COX-2、VEGF-CmRNA表達(dá)的交互作用。 結(jié)果：塞來昔布對COX-2mRNA表達(dá)的抑制作用較弱，但對VEGF-CmRNA表達(dá)的抑制作用有顯著性意義，與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后，對VEGF-CmRNA表達(dá)的抑制呈交互增強作用。塞來昔布與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后抑制移植瘤生長的同

15、時，促進(jìn)移植瘤組織的變性、壞死及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。塞來昔布抑制移植瘤生長的作用可能與抑制COX-2蛋白表達(dá)有關(guān)，其具體作用機制尚待進(jìn)一步研究。 總之，本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與VEGF-C在舌癌組織中呈強陽性表達(dá)，并與舌鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，COX-2和/或VEGF-C可以作為臨床判斷腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移潛能及估計預(yù)后重要的參考指標(biāo)。選擇性COX-2抑制劑塞來昔布主要以劑量依賴方式通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)凋亡從而抑制人舌

16、鱗癌Tca8113細(xì)胞生長。同時，塞來昔布能增強抗癌藥CDDP和BLM對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用，塞來昔布與CDDP、BLM聯(lián)合應(yīng)用后對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用呈協(xié)同或相加作用。大劑量的塞來昔布(200mg/kg·d-1)單獨應(yīng)用，能夠抑制裸鼠Tca8113細(xì)胞移植瘤的生長，與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后，能增強CDDP對裸鼠移植瘤的生長抑制作用。塞來昔布在抑制裸鼠移植瘤生長的同時，抑制腫瘤組織COX-2和VEGF蛋白的表達(dá)。塞來昔布與C

17、DDP聯(lián)合應(yīng)用能增強抑制Tca8113細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF-CmRNA表達(dá)，兩者之間有交互增強作用，而塞來昔布對COX-2mRNA的表達(dá)則無明顯抑制作用，其與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后對COX-2mRNA的表達(dá)無交互增強作用，提示COX-2抑制劑塞來昔布的抗腫瘤作用可能主要是抑制COX-2酶的活性。塞來昔布抑制裸鼠移植瘤生長的同時，促進(jìn)移植瘤組織的變性、壞死及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。以上這些研究結(jié)果，為今后更深入研究COX-2與口腔癌的發(fā)生，以及選