人腦膠質(zhì)瘤中促血管生成素-2的表達(dá)與血管形成相關(guān)性研究.pdf

1、目的：膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率高，五年生存率低。它是一種富含血管的惡性腫瘤，且具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，血管的生成有利于腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。侵襲性生長(zhǎng)是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞療效差的主要原因之一，而新生血管是腫瘤侵襲性生長(zhǎng)過程中的必然現(xiàn)象。故研究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的特征有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤性的血管生成。而腫瘤的血管生成又受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共

2、同調(diào)節(jié)。促血管生成素AngiopoietiFns(Angs)是近年發(fā)現(xiàn)的與血管生成有關(guān)的因子，包括Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4等，其中Ang2與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)有協(xié)同作用，在腫瘤血管生成中起著至關(guān)重要的作用。膠質(zhì)瘤是典型的血管依賴性實(shí)體腫瘤。因此研究Ang-2和VEGF相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制，可以為治療腦膠質(zhì)瘤提供新思路。本研究的目的是通過對(duì)腦膠質(zhì)瘤中Ang-2、VEGF及微血管密度(MVD)進(jìn)行檢測(cè)，探

3、討它們之間的關(guān)系及在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及與膠質(zhì)瘤惡性程度與預(yù)后的關(guān)系。 方法：選取2003年～2004年于河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本49例，其中男性患者27例，女性22例。年齡6-76歲，平均45.2±11.7歲。其中＜60歲者35例，＞60歲者14例。臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間5天～2年，平均兩個(gè)月。所有患者術(shù)前均未行化療、放療及免疫治療。腫瘤臨床病理按WHO(2000)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分

4、類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類和分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)10例(毛細(xì)胞性星形細(xì)胞瘤8例，脈絡(luò)叢乳頭狀瘤2例)；Ⅱ級(jí)9例(纖維性星形細(xì)胞瘤4例，原漿性星形細(xì)胞瘤2例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例，肥胖細(xì)胞性星形細(xì)胞瘤1例)；Ⅲ級(jí)13例(間變性星形細(xì)胞瘤11例，間變性室管膜瘤2例)；Ⅳ級(jí)17例(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤12例，髓母細(xì)胞瘤5例)。另取5例取自同期因急性顱腦損傷行內(nèi)減壓手術(shù)的正常腦組織作為對(duì)照，其中男3例，女2例。每例標(biāo)本均分為兩部分：一部分于術(shù)中離體30分鐘內(nèi)取材，立即置入

5、液氮速凍，并保存于-80℃冰箱，用于RT-PCR；另一部分標(biāo)本均用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色。每例標(biāo)本做5μm厚連續(xù)切片備用，并做HE染色確定診斷。 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)：應(yīng)用S-P免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)促血管生成素-2、VEGF及微血管密度(Mcrovasculardensity,MVD)，每種免疫組化染色均設(shè)陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果判定促血管生成素-2陽性染色均定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞

6、的胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞成不均散分布。VEGF表達(dá)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色，不均散分布。以高倍視野(×400)下陽性細(xì)胞數(shù)量綜合判斷，采用半定量分析法。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)以上高倍視野，鏡下視野清晰，無壞死、出血，計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞的陽性率。每個(gè)玻片計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞，求出陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，用標(biāo)記指數(shù)(Labellingindex，LI)表示：LI(％)=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)×100％。同時(shí)分別將陽性腫瘤細(xì)胞分為4個(gè)等級(jí)：無陽性細(xì)胞

7、為“-”；陽性細(xì)胞＜30％為“+”；陽性細(xì)胞30％～60％為“++”；陽性細(xì)胞＞60％為“+++”。 所有結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，mRNA表達(dá)指數(shù)(RI)及標(biāo)記指數(shù)(LI)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。對(duì)結(jié)果采用t檢驗(yàn)，方差分析，卡方檢驗(yàn)，秩和檢驗(yàn)及直線回歸及相關(guān)分析等方法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)采用p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了膠質(zhì)瘤49例，正常腦組織5例作為對(duì)照，Ang-2、VEGF、MVD在

8、正常腦組織及不同惡性度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及它們之間的相關(guān)性如下： 1Ang-2陽性染色均定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中，其中大部分在胞核表達(dá)，Ang-2蛋白在49例膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，5例正常腦組織中Ang-2蛋白無陽性；在10例Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細(xì)胞的百分率均數(shù)為0.1788±0.0108；在9例Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細(xì)胞的百分率均數(shù)為0.2202±0.0083；在13例Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ang-

9、2蛋白陽性腫瘤細(xì)胞的百分率均數(shù)為0.2809±0.0107；17例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細(xì)胞的百分率均數(shù)為0.3536±0.0068。且在高度惡性膠質(zhì)瘤中Ang-2蛋白在腫瘤與正常腦組織交界處，腫瘤內(nèi)壞死組織周圍高表達(dá)，兩者周圍區(qū)低表達(dá)。由此可見膠質(zhì)瘤組織中Ang-2陽性蛋白表達(dá)率明顯高于正常腦組織，且在惡性度高的膠質(zhì)瘤明顯高于低度惡性的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)X2檢驗(yàn)分析其差別非常有顯著性P＜0.01。 2VEG

10、F表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)中，5例正常腦組織無VEGF表達(dá)VEGF表達(dá)陽性率為0.0895±0.0085，10例Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)陽性率0.1812±0.0078，9例Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)陽性率0.2302±0.0087，13例Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)陽性率0.3491±0.0079，17例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)陽性率0.4377±0.0146。膠質(zhì)瘤VEGF陽性表達(dá)率顯著高于正常腦組織，其表達(dá)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各級(jí)膠質(zhì)瘤之間有顯著

11、差異性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)X2檢驗(yàn)分析其差別非常有顯著性P＜0.01。 3經(jīng)過微血管密度測(cè)定，正常腦組織和腫瘤組織間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)，正常腦組織中微血管數(shù)量較少，形態(tài)規(guī)則，而腫瘤組織中微血管數(shù)量較多，形態(tài)不規(guī)則。檢測(cè)得到5例正常腦組織的MVD為6.2±1.5，10例Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤的MVD為13.4±1.6，9例Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤的MVD為29.02±1.8，13例Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤的MVD為48.2±1.2，17例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的MVD為

12、80.0±2.0。正常腦組織、Ⅰ到Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中MVD逐漸增高，經(jīng)檢驗(yàn)差異顯著P＜0.01。 4Ang-2、VEGF、MVD的相關(guān)性正常腦組織中Ang-2、VEGF、MVD不表達(dá)或者弱表達(dá)，所有膠質(zhì)瘤中，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高，它們的陽性表達(dá)水平明顯升高。Ang-2表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD密切相關(guān)(p＜0.01)，Ang-2、VEGF、MVD在正常腦組織與不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)率呈顯著正相關(guān)。 結(jié)論：Ang-2、VE