ERK通路參與調(diào)節(jié)MDR-1、RRM1基因表達介導(dǎo)胰腺癌細胞吉西他濱化療抵抗.pdf

1、背景:胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，由于其早期臨床癥狀不明顯，80﹪患者確診時屬于晚期，而化療是晚期胰腺癌的主要治療手段。 目前吉西他濱單藥是晚期胰腺癌的標準的一線化療方案，但其中位生存期僅5.4-5.6個月，1年生存率僅為16﹪-19﹪，療效較差。 胰腺癌化療失敗的豐要原因之一是胰腺癌細胞的多藥耐藥，多藥耐藥是指腫瘤細胞接觸某一種抗癌藥物的同時，對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物產(chǎn)生耐藥。吉西他濱化療失敗的原因也是胰腺癌細胞在化療過

2、程中產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象，作為胰腺癌化療的一線用藥，探討其耐藥機制顯的十分重要。 細胞膜糖蛋白p-gp是多藥耐藥基因mdr-1的表達產(chǎn)物。P-gp為一能量依賴的單向藥物外排泵，可將進入細胞內(nèi)的藥物排出細胞外，由此引起的細胞內(nèi)藥物積聚減少是MDR的主要原因。多數(shù)腫瘤細胞膜上可檢測到p-gp的過度表達，在正常胰腺細胞中檢測到p-gp的表達為33﹪，而胰腺癌細胞中p-gp的表達高至71﹪，因此胰腺癌被認為是天然耐藥的腫瘤之一。要潔等研究表明

3、胰腺癌耐吉西他濱細胞株中mdr-1的表達較其親本細胞升高。 吉西他濱是細胞周期特異性抗代謝藥物，它在體內(nèi)由脫氧胞苷激酶(dCK酶)代謝為其活性產(chǎn)物---吉西他濱二磷酸鹽(dFdCDP)和吉西他濱三磷酸鹽(dFdCTP)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用的。RR有兩個亞基組成-RRM1和RRM2，其中RRM1是核苷酸結(jié)合位點，控制底物的特異性和整個酶的活性，同時也是核昔類似物系的化療藥物的結(jié)合位點。多項研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吉西他濱作為一種影響因素作用于

4、腫瘤細胞時，RRM1表達水平增高會使腫瘤細胞對化療藥的耐藥性增加。近來的幾項研究也表明在耐吉西他濱胰腺癌細胞中RRMl的表達升高，可能是導(dǎo)致胰腺癌耐吉西他濱的一個重要因素。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kirlase MAPK)家族是信號傳導(dǎo)中最主要的成分，可將不同的細胞外信息轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)反應(yīng)。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族的一個亞組，可被許多細胞因子和生長

5、因子激活，介導(dǎo)細胞增殖，分化等信號傳導(dǎo)。ERK1和ERK2是其中的兩個重要成員，它們所參與的信號傳導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有關(guān)。有體外和動物實驗證明ERK通路的激活不僅與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，并且ERK的過度激活與腫瘤化療的耐藥相關(guān)，其機制可能是通過上調(diào)腫瘤耐藥相關(guān)基因的表達。趙玉沛等發(fā)現(xiàn)在胰腺癌耐藥細胞株中，ERK蛋白明顯升高，并且使用ERK通路阻斷劑后，細胞的耐藥會得到部分逆轉(zhuǎn)，因此推測ERK通路可能參與了胰腺癌細胞耐藥形成。 由以

6、上理論，mdr-1基因編碼的p-gp蛋白可以改變細胞內(nèi)藥物的分布，而RRMl又是吉西他濱的作用靶點，是吉西他濱特異性結(jié)合位點，ERK通路又可能參與了胰腺癌細胞的耐吉西他濱的過程，我們設(shè)想是否ERK通路調(diào)節(jié)胰腺癌細胞耐吉西他濱的形成是通過mdr-1、RRM1的表達升高而實現(xiàn)的。理論上來講，此觀點是行的通的，ERK通路參與了胰腺癌耐吉西他濱的過程，而胰腺癌形成耐藥的過程與藥物的分布及代謝情況密切相關(guān)，p-gp與RRM1分別是決定藥物分布與代

7、謝的兩個重要因素。近來有研究表明ERK通路與mdr-1基因之間可能存在著關(guān)聯(lián)，即ERK通路可能是通過調(diào)節(jié)mdr-1基因而改變化療藥物的敏感性的，但這一實驗是在胃癌細胞中進行的，目前在胰腺癌中尚無相關(guān)報道。目前國內(nèi)外尚無同樣研究，本實驗初步探討了ERK通路與胰腺癌細胞耐吉西他濱的機制之問的內(nèi)在聯(lián)系，并且與臨床實踐中的難點相結(jié)合的，具有一定的科研及臨床價值。 目的:通過建立胰腺癌細胞吉西他濱化療抵抗模型，動態(tài)檢測不同藥物濃度下ERK

8、、 mdr-1、RRM1的表達情況，并分別用ERK通路的激活劑與阻斷劑作用，觀察它們?nèi)叩淖兓厔?，初步探討胰腺癌細胞吉西他濱化療抵抗的可能機制。 材料和方法: 1 細胞和免疫細胞化學(xué)方法胰腺癌細胞株由中山大學(xué)動物中心提供。將潔凈的載玻片置于6孔培養(yǎng)板，細胞消化后以一定細胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，置于含5﹪CO<,2>、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸去上層培養(yǎng)基，固定細胞，風(fēng)干。進行免疫SP法染色。 2 細胞培養(yǎng)和

9、藥物處理胰腺癌細胞株SW1990用含GEM的RPMI1640培養(yǎng)基(含10﹪胎牛血清，GEM在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0、30、60、100、150、200nmol/l)，置于含5﹪CO<,2>、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 實驗分組：吉西他濱單藥組(簡稱GEM組)、GEM+U0126組、GEM+EGF組。 3 MTT法檢測各實驗組中胰腺癌細胞的增殖抑制作用及IC50。 以4X10<'4>個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板上

10、，24小時后換不同濃度、不同種類藥物的培養(yǎng)基，分別作用24、48、72小時后酶標儀檢測OD492光密度值。 細胞的相對抑制率(Inhibition rate，IR)由以下公式計算： IR=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×1000﹪ 通過對細胞的抑制率求出相應(yīng)各組的IC50。 4 統(tǒng)計分析 免疫組化圖片用image pro-plus軟件進行半定量分析(其中ERK灰度值與ERK蛋白表達成反比關(guān)系)

11、，RT-PCR結(jié)果使用Band凝膠軟件進行半定量分析，結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 10.0軟件完成，對相關(guān)指標進行線性相關(guān)分析，并對MTT結(jié)果進行分析，計算IC50值。 結(jié)果: 1.建立的GEM化療抵抗胰腺癌細胞株模型經(jīng)過濃度梯度遞增法誘導(dǎo)的胰腺癌GEM化療抵抗細胞株，細胞可以在GEM終濃度為0、30、60、100、150、200nmol/l的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并傳代，這種方法與臨床化療耐藥的過程十分接近，是一種十分接

12、近臨床腫瘤化療后產(chǎn)生耐藥的方法，對于探討臨床腫瘤化療后耐藥的機理更有意義。 2.不同GEM濃度化療抵抗的胰腺癌細胞株中ERK、mdr-1、RRM1基因的表達隨著GEM濃度的提高，ERK、 mdr-1、RRM1的表達也同步升高，進行統(tǒng)計分析，GEM濃度/mdr-1、GEM濃度/RRM1、ERK/mdr-1、ERK/RRM1之間均存在高度相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.966、-0.943、-0.883，并都取得了統(tǒng)計學(xué)意義

13、。 3.使用阻斷劑、激活劑后三者的表達情況0nmol/l濃度的GEM化療抵抗細胞株，用ERK通路阻斷劑作用于后，細胞株的ERK灰度值由248.28±11.03上升為283.17±12.45、mdr-l表達由0.81±0.07下降為0.2±0.01、RRM1的表達由1.27±0.06下降為0.25±0.02；200nmol/l濃度的GEM化療抵抗細胞株用ERK通路阻斷劑作用于后，細胞株的ERK灰度值由164.22±13.17上升為

14、186.85±13.14，mdr-1表達由1.41±0.04下降為0.23±0.02，RRM1的表達由1.45±0.18下降為0.21±0.03。而0nmol/l濃度的GEM化療抵抗細胞株在經(jīng)過EGF作用后，細胞株的ERK灰度值由248.28±11.03下降為116.35±16.13、mdr-1表達由0.81±0.07上升為1.22±0.05、RRM1的表達由1.27±0.06上升為1.35±0.06；200nmol/l濃度的GEM化療

15、抵抗細胞株在經(jīng)過EGF作用后，細胞株的ERK灰度值由164.22±13.17下降為106.55±16.45，mdr-1表達由1.41±0.04上升為1.5±0.07，RRM1的表達由1.45±0.18上升為1.52±0.12。由于ERK蛋白灰度與表達成反比，因此由以上數(shù)據(jù)ERK、mdr-1、RRMl三者呈現(xiàn)ERK通路阻斷后同步降低，ERK通路激活后同步升高的趨勢。 4.MTT法測IC50值隨著GEM化療抵抗的濃度由0nmol/l

16、升高到200nmol.l，其IC50值也由4.104增加到10.2，經(jīng)U0126處理后，0nmol/l的IC50值由4.104下降到3.26，200nmol/l的IC50值由10.2下降到4.5。經(jīng)EGF處理后，0nmol/l的IC50值由4.104上升到8.89，200nmol/l的IC50值由10.2上升到17.17。 結(jié)論: 1.mdr-1、RRM1基因的表達上調(diào)可導(dǎo)致胰腺癌細胞GEM化療抵抗。 2.ERK