胰腺癌干細(xì)胞的分離鑒定及吉西他濱和低氧微環(huán)境對胰腺癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　1）采用流式細(xì)胞術(shù)SP細(xì)胞分選法分離鑒定胰腺癌SP細(xì)胞符合胰腺癌干細(xì)胞特性并表達(dá)干性基因。
　　2）研究胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性及吉西他濱對人胰腺癌CSC的富集作用。
　　3）研究低氧微環(huán)境下人胰腺癌細(xì)胞基本生物學(xué)性狀，探討低氧微環(huán)境對人胰腺癌CSC的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1）選用人胰腺癌細(xì)胞系Bxpc-3、Panc-1、SW1990，采用流式細(xì)胞術(shù)SP分選法分離出SP細(xì)胞；
　

2、　2）采用平板克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析、Transwell法檢測侵襲和遷移能力、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)研究SP細(xì)胞亞群的基本生物學(xué)特性；
　　3）采用Real-Time qPCR法檢測SP細(xì)胞亞群和非SP細(xì)胞亞群中OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2、CD133、ALDH1的表達(dá)水平；
　　4）采用流式細(xì)胞術(shù) SP分選法檢測吉西他濱干預(yù)后的人胰腺癌 SP細(xì)胞比例及OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2、

3、CD133、ALDH1基因表達(dá)；
　　5）體外細(xì)胞低氧培養(yǎng)模擬體內(nèi)低氧微環(huán)境，通過Western blot檢測HIF-1α蛋白表達(dá)監(jiān)測胰腺癌細(xì)胞的缺氧狀態(tài)；
　　6）通過細(xì)胞生長形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期研究低氧微環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞的基本生物學(xué)特性；
　　7）通過 Western blot檢測 E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表達(dá)從而監(jiān)測低氧微環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞EMT；
　　8）采用Real-Time

4、 qPCR法檢測低氧微環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞中OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2、CD133、ALDH1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1）人胰腺癌細(xì)胞系Bxpc-3、Panc-1、SW1990均含有SP細(xì)胞亞群，比例（％）分別是0.58±0.02，8.74±0.33，3.92±0.16；
　　2）胰腺癌細(xì)胞SP細(xì)胞亞群和non-SP細(xì)胞亞群克隆形成能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SP細(xì)胞有更強(qiáng)的克隆形成能力；SP細(xì)

5、胞具有增殖分化能力；SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞亞群細(xì)胞周期分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SP細(xì)胞更多處于靜止期；SP細(xì)胞的侵襲和遷移能力均強(qiáng)于non-SP細(xì)胞（P<0.05）；SP細(xì)胞成瘤能力至少是非non-SP的100倍；
　　3）SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞亞群中OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2、CD133、ALDH1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SP細(xì)胞亞群OCT4表達(dá)/non-SP細(xì)胞亞群OCT4表達(dá)為

6、123.8±12.89倍、SOX2為187.76±10.22倍、Nanog為45.36±3.44倍、ABCG2為1321±112.89倍、CD133為237.67±37.45倍、ALDH1為68.78±5.56倍；
　　4）SP細(xì)胞較非 SP細(xì)胞對吉西他濱有更強(qiáng)的耐受性，吉西他濱干預(yù)人胰腺癌細(xì)胞系后 SP細(xì)胞比例升高伴隨OCT4、SOX
　　2、Nanog、ABCG2、CD133、ALDH1基因表達(dá)上調(diào)；
　　5）低氧

7、微環(huán)境下HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)；
　　6）低氧微環(huán)境下細(xì)胞生長形態(tài)差異明顯，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜形態(tài)均發(fā)生明顯變化；細(xì)胞增殖較慢，細(xì)胞生長曲線無明顯對數(shù)生長期；細(xì)胞周期分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三株胰腺癌細(xì)胞多處于靜止?fàn)顟B(tài)；
　　7）低氧微環(huán)境下E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，胰腺癌細(xì)胞更容易發(fā)生EMT；
　　8）低氧微環(huán)境下基因OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2

8、、CD133、ALDH1的mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）胰腺癌SP細(xì)胞具有胰腺癌CSC特性，流式細(xì)胞術(shù)SP分選法是分離胰腺癌干細(xì)胞的可靠方法；
　　2）胰腺癌細(xì)胞OCT4、SOX2、Nanog、ABCG2、CD133、ALDH1基因是胰腺癌干細(xì)胞的干性基因；
　　3）吉西他濱可以富集胰腺癌干細(xì)胞，通過檢測胰腺癌干性基因OCT4、SOX2、Nanog、ALDH1、CD133和ABCG2表達(dá)