鉤端螺旋體外膜脂蛋白Loa22的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、目的:構(gòu)建鉤端螺旋體外膜脂蛋白Loa22基因的原核表達(dá)載體pQE31-Loa22,并在大腸桿菌M15中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。Loa22蛋白免疫豚鼠,研究其在豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生的的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,并通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)檢測(cè)其免疫保護(hù)性,為研制鉤端螺旋體疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:以賴型鉤端螺旋體56601株基因組為模板,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增大小為516 bp的目的基因片段。Loa22基因克隆至原核表達(dá)載體,構(gòu)建pQE31-Loa

2、22。重組質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 M15中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blot鑒定目的蛋白。于0 w、2 w、4 w將蛋白及對(duì)照PBS分別經(jīng)豚鼠腹股溝、腋下、背部多處免疫豚鼠。末次免疫后2 w,用培養(yǎng)7d的56601株鉤端螺旋體從腹腔攻擊各免疫組豚鼠(1mL/只)。連續(xù)觀察15天,觀察各免疫組豚鼠發(fā)病情況,并取各免疫組豚鼠的肺、肝、腎做病理切片,HE染色觀察比較各免疫組豚鼠的組織病理變化。分

3、析蛋白Loa22對(duì)豚鼠的免疫保護(hù)作用。ELISA法測(cè)定各免疫組豚鼠血清中抗體水平。無(wú)菌分離豚鼠脾淋巴細(xì)胞,MTT比色法檢測(cè)各免疫組豚鼠脾淋巴細(xì)胞的體外增殖反應(yīng),計(jì)算刺激指數(shù)。ELISA測(cè)定Loa22蛋白抗血清與致病性鉤端螺旋體56607、56603、56609株的交叉免疫反應(yīng)。通過(guò)Fontana鍍銀染色法檢測(cè)Loa22蛋白抗血清對(duì)鉤端螺旋體56601株黏附Raw264.7細(xì)胞的阻斷情況。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增出為516bp的目的片

4、段。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序和雙酶切鑒定構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 M15后,SDS-PAGE、Western-blot檢測(cè)目的基因能表達(dá) Mr為22KD的蛋白。豚鼠接種Loa22蛋白后產(chǎn)生了特異性抗體,末次免疫后2 w豚鼠血清抗體最高滴度均達(dá)到了1:8000,而接種PBS的豚鼠血清中無(wú)特異性抗體。蛋白免疫組豚鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)蛋白刺激后刺激指數(shù)(3.25±0.37)明顯高于 PBS對(duì)照組(1.38±0.13)。Loa22蛋白免疫的豚鼠用5660

5、1株鉤體攻擊,經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察無(wú)發(fā)病現(xiàn)象,HE染色顯示各組織沒(méi)有病理改變。而PBS免疫的豚鼠在實(shí)驗(yàn)中不同程度的出現(xiàn)食欲不振、活動(dòng)減少等現(xiàn)象,HE染色顯示各組織均有明顯的病理改變。Loa22蛋白抗血清與致病性鉤體56607、56603和56609株具有良好的交叉免疫反應(yīng)(效價(jià)為1/409600、1/819200、1/3376800)。Loa22蛋白抗血清稀釋比率為1:50時(shí)黏附抑制率為90％,稀釋比率為1:400時(shí)黏附抑制率為50%。
　

6、　結(jié)論:
　　(1)成功擴(kuò)增了Loa22基因,并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pQE31-Loa22。并在大腸桿菌M15表達(dá)出Mr約為22KD的重組蛋白。
　　(2) Loa22蛋白在豚鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)較強(qiáng)的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　(3) Loa22蛋白在豚鼠體內(nèi)誘生的免疫應(yīng)答能抵抗同型鉤體感染。
　　(4) Loa22蛋白抗血清與不同血清型鉤體具有交叉免疫反應(yīng)。
　　(5) Loa22蛋白抗血清能夠阻斷鉤