鉤端螺旋體病疫苗相關(guān)外膜蛋白的研究.pdf

1、本研究分為以下二部分： 第一部分：鉤端螺旋體病疫苗相關(guān)外膜蛋白的研究 鉤端螺旋體屬于螺旋體目螺旋體科鉤端螺旋體屬。其中致病性鉤體引起鉤體病，此病人畜共患并呈全球分布。人通過直接或間接接觸感染動物的尿液而感染。鉤體病的臨床特點為高熱、頭痛、寒戰(zhàn)、乏力、淋巴結(jié)腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可并發(fā)肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。為更好的防治鉤體病，疫苗的研究一直是鉤端螺旋體研究的重點。楊宏亮等首先以完成測序的問號鉤端螺旋體黃

2、疸出血群賴型賴株(56601株)和哥本哈根型FiocruzL1-130株等的全基因組序列為基礎(chǔ)，運用生物信息學方法，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、比較基因組學方法，篩選出了226個可能的疫苗候選基因。 本實驗從中選擇了9個預(yù)測表達于外膜的疫苗候選基因(LA1100、LA0301、LA3469、LA3744、LA1507、LA2208、LA2757、LA3506、LA0957)進行了克隆表達純化，得到了九個相應(yīng)的重組蛋白并制備了相應(yīng)的抗體。運用此

3、純化的蛋白，通過westernblot檢測了這9個蛋白在鉤端螺旋體全菌疫苗免疫后金黃地鼠的血清中抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果表明除LA3506外，其余8個重組蛋白的抗體均能在血清中檢出。 本課題對其中LA3744和LA1100兩個基因所編碼蛋白進行了深入研究。PCR和Westernblot檢測了它們在15個中國流行的血清群代表株中的保守性，發(fā)現(xiàn)這兩個基因及其編碼的蛋白在中國流行的15個血清群代表株的14株中均有相當高的保守性，且在非致病

4、性雙曲鉤端螺旋體未檢出。熒光激活的細胞分選(FACS)、表面免疫熒光(surfaceimmun of luorescence)及TritonX-114分離鉤體膜組分等3種方法檢測編碼蛋白的亞細胞定位，證實這兩種蛋白是鉤體表面暴露蛋白，但LA3744所編碼pL40蛋白只存在于外膜，而LA1100編碼蛋白PL61在外膜和周漿間隙均有分布。ELISA分別檢測感染鉤端螺旋體的小鼠、豚鼠和金黃地鼠不同時間段血清中這兩個重組蛋白抗體滴度，三種血清中

5、都能檢出pL40抗體，而且在從第7天到第28天不同感染時間的血清其抗體滴度逐漸增高，說明當致病性鉤體56601株感染哺乳動物時，有pL40蛋白表達。據(jù)此推測pL40可能在鉤體致病中發(fā)揮作用。由于其在致病株中的保守性以及其為螺旋體中的特有蛋白，因此可以作為一個有價值的診斷抗原和疫苗候選蛋白進行進一步的研究。與PL40蛋白不同，在這三種血清中均未檢出PL61抗體。為了檢測PL61蛋白在鉤端螺旋體感染時是否表達，分離體內(nèi)感染的鉤體進行west

6、ernblot，也未檢出該蛋白表達，此蛋白可能為鉤體體外特異表達的蛋白，對此蛋白進行進一步研究有助于在分子水平闡明鉤端螺旋體適應(yīng)體內(nèi)外復雜環(huán)境的調(diào)控機制。 第二部分：鉤端螺旋體不同傳代次數(shù)的致病株與減毒株表達譜差異的研究 鉤端螺旋體由于缺乏有效的遺傳工具，對其研究，尤其對其致病機制的研究還較困難，因此對其致病機理的研究還不是很深入。本實驗室于2004年根據(jù)2002年完成的鉤端螺旋體的全基因組測序工作注釋的ORFs設(shè)計了鉤

7、端螺旋體的cDNA芯片，并根據(jù)此芯片進行了毒力株不同傳代次數(shù)之間表達譜差異的研究。本試驗擬通過該芯片，分別研究了不同傳代的毒力株和減毒株間表達譜的差異。 鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株56601株(中賴)與減毒株鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株IPAV(法賴)雖然遺傳背景上相似，但毒力卻有很大的差別。本試驗以37℃為試驗的培養(yǎng)條件，分別以原代培養(yǎng)的鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株56601和體外傳代20次的56601株為測試株

8、，以鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株IPAV株為對照株，利用鉤端螺旋體的cDNA芯片測試了不同傳代次數(shù)毒力株與減毒株芯片表達譜的差異。結(jié)果表明，無論是原代還是第二十代毒力株和減毒株的表達譜均具有明顯的差別。原代56601株上調(diào)表達的基因有103個，下調(diào)表達的有85個；第二十代56601株上調(diào)表達的基因有217個，下調(diào)表達的有193個。這些差異表達的基因在功能上可以分12類，分屬于致病相關(guān)基因、無機離子運輸基因、信號傳導機制相關(guān)基因、細胞壁/

9、膜合成相關(guān)基因、細胞周期調(diào)控基因、蛋白質(zhì)翻譯后修飾及折疊基因、防御機制相關(guān)基因、新陳代謝相關(guān)基因、細胞動力相關(guān)基因、胞內(nèi)分選及分泌相關(guān)基因、信息存儲及加工基因及其它功能基因。這些差異表達的基因可能與鉤端螺旋體致病有關(guān)。 從芯片結(jié)果還可看出，體外傳代二十次的鉤端螺旋體體內(nèi)發(fā)生了較為明顯的變化。變化較為明顯基因包括細胞動力相關(guān)基因、細胞壁及膜生成相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因及新陳代謝相關(guān)基因等，這些可能與以前所報道的細胞膜分子的變化及