鉤端螺旋體外膜蛋白血清學診斷價值和CTB-OmpL1疫苗免疫保護作用評價.pdf

1、背景與目的:
　　以問號鉤端螺旋體為代表的致病性鉤端螺旋體廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，引起的人獸共患病稱為鉤端螺旋體病，簡稱鉤體病。該病是我國重點防控的傳染病之一，目前常用診斷鉤體病的方法和應用的疫苗存在各自的缺點。近年的研究表明，外膜蛋白是鉤體外膜中的重要組成部分，其中多種組分具有致病性和免疫原性。本研究為提高血清學檢測的敏感性和特異性，克隆、表達LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8，并以這4種重組

2、蛋白為抗原，建立檢測馬和狗血清中相應抗體的ELISA和狗血清中相應抗體的LUMINEX法，為研制診斷鉤體病的新血清學檢測方法奠定實驗基礎。應用分子生物學方法，構建CTB-OmpL1重組乳酸菌口服疫苗，并利用倉鼠模型評價其免疫保護作用，為研制新型疫苗奠定基礎。
　　研究內容與方法:
　　1.采用PCR方法，從鉤端螺旋體基因組DNA中分別擴增LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8基因片段，構建原核表達載體L

3、ipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8-PET28/ Rosetta，大量誘導表達重組菌，運用Ni+NTA及正負離子吸咐柱純化獲得重組蛋白，用Wester blot鑒定。
　　2.以重組蛋白LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8為抗原，建立檢測馬血清和狗血清中相應抗體的ELISA，用建立的ELISA檢測

4、大量臨床馬血清和狗血清并與傳統(tǒng)MAT比較，評價其診斷價值。
　　3.以重組蛋白LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8為抗原，建立檢測狗血清中相應抗體的Luminex法，檢測大量臨床狗血清中相應抗體，并與傳統(tǒng)MAT比較，評價其診斷價值。
　　4.用基因工程技術，克隆、表達鉤端螺旋體重組蛋白CTB-OmpL1，轉入乳酸菌中制備CTB-OmpL1口服疫苗;制備倉鼠鉤體感染動物模型，通過該模型評價該口服疫苗的免

5、疫保護作用。
　　結果:
　　1.成功構建了重組表達質粒LipL21-PET28/Rosetta，Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21, LigACon4-8-PET28/Rosetta，雙酶切鑒定基因完整，基因測序結果表明與Genebank基因序列基本一致，表達重組菌后獲得2-5mg/ml濃度，純度達90％以上的高濃度的純化蛋白。Wester blot結果顯示重組蛋白能與感染鉤體

6、的馬和狗血清發(fā)生反應。
　　2.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原建立的ELISA檢測130例MAT陰性和176例MAT陽性馬血清，對馬血清檢測結果，其敏感性分別可達84.66％，77.84％，77.84％，82.39％，特異性達83.85％，92.31％，86.15％，86.15％。
　　3.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原與203例MA

7、T陽性，102例MAT陰性狗血清作ELISA檢測，其敏感性分別可達99.5％，89.7％，92.6％，97.5％，特異性達84.3％，81.4％，84.3％,84.3％。
　　4.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原建立了檢測狗血清中相應抗體的Luminex法，檢測了203例MAT陽性，20例MAT陰性狗血清，其敏感性分別可達89.66％，75.86％，82.27％，78.33％，特異性達8

8、5.0％，80.0％，90.0％，80.0％。
　　5.構建了重組CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗，建立了鉤體感染的倉鼠動物模型;口服疫苗免疫倉鼠后可產生較好的免疫保護較果，攻毒后免疫倉鼠存活率可達87.5％。
　　結論:
　　成功表達LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8，獲得高純度的重組蛋白，均具有良好的抗原性。成功建立了檢測馬和狗血清中鉤體抗體的ELISA，成功建立了檢測狗血清中鉤體抗體的L