鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32的克隆、表達及其在鉤端螺旋體抗體檢測中的應(yīng)用.pdf

1、鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的一種人獸共患的自然疫源性疾病。鉤體血清型別眾多，臨床表現(xiàn)多種多樣。目前鉤體病血清學(xué)的主要檢測方法是國家標準即顯微鏡凝集試驗(MAT)，需要培養(yǎng)各種血清型的鉤體活菌，操作繁瑣，安全性差且需要暗視野顯微鏡，無法在基層開展該項目的檢測工作。鉤體外膜脂蛋白LipL32是各種致病性鉤體中高度保守的抗原成份，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體。因此該抗原有可能應(yīng)用于抗體檢測。 本課題用PC

2、R法擴增致病性鉤端螺旋體黃疸出血群(56601株)LipL32蛋白的全長基因片段，與表達載體pET-30a(+)連接并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組蛋白，Western blot鑒定免疫活性后用電洗脫法進行純化。純化后的LipL32重組蛋白用間接ELISA和夾心ELISA法對不同的人和動物血清進行檢測，以MAT為參照標準進行比較。 主要結(jié)果如下： 1.純化的重組蛋白用間接ELIsA和夾心ELISA法對致病性鉤體1

3、5株標準菌株的兔免疫血清全部檢出，對7株腐生性鉤體菌株的兔免疫血清全部未檢出，與MAT檢測結(jié)果相符。表明該重組蛋白能區(qū)別腐生性和致病性鉤體感染。進一步確證黃疸出血群(5660l株)外膜脂蛋白LipL32基因在致病性鉤體中高度保守。 2.重組蛋白檢測確診鉤體病人的9例急性期和恢復(fù)期雙份血清標本，急性期9份血清，MAT有2份出現(xiàn)陽性，間接ELISA和夾心ELISA法分別可檢出3份和2份陽性，進口ELISA檢測試劑盒則是2份陽性，4份

4、可疑。對于恢復(fù)期9份血清，MAT檢出9份陽性，間接ELISA和夾心ELISA法均檢出8份陽性，進口ELISA則是1份陽性，7份可疑。提示該重組蛋白包被的間接ELISA和夾心ELISA在鉤體病檢測方面與MAT相似，恢復(fù)期優(yōu)于進口試劑盒。 3.重組蛋白檢測不同血清標本，45份MAT陽性標本，間接ELIsA法敏感性為71.11％(32/45)，夾心ELISA敏感性為80.00％(36/45)，而進口ELISA試劑盒檢測則是陽性13份，

5、占28.89％(13/45)，25份可疑占55.56％(25/45)。在特異性檢測方面，檢測MAT陰性血清59份(其中健康體檢血清43份，非鉤體發(fā)熱病人16份，包括恙蟲病陽性和出血熱陽性各8份)間接ELISA和夾心ELISA法特異度均為96.61％(57/59)，進口ELISA檢測健康體檢血清14份，均為陰性，檢測非鉤體發(fā)熱病人16份，則出現(xiàn)1份陽性，12份可疑。對梅毒螺旋體質(zhì)控陽性血清10份，四種方法均為陰性。證明該重組抗原在敏感性方

6、面略高于進口試劑盒，特異性與MAT相同，大大好于進口試劑盒，在鉤體流行病學(xué)大樣本人群調(diào)查中可用于初篩。 4.重組蛋白應(yīng)用于夾心ELISA法檢測鼠血清標本，以MAT為標準。檢測274份標本，夾心ELISA的敏感性為86.75％(131/151)，特異性為99.19％(122/123)，符合率為92.34％(253/274)。結(jié)果表明夾心ELISA對鼠血清鉤體抗體的檢測顯示較好的敏感性和特異性。夾心ELISA操作簡單，特別適用于大樣