梅毒螺旋體外膜蛋白核酸疫苗的篩選構(gòu)建及其免疫效果的比較研究.pdf

1、目的：篩選比較梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性，分別構(gòu)建真核表達重組體pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和雙基因融合表達重組體pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92，檢測其所誘導產(chǎn)生的體液免疫和細胞免疫應答水平，比較單基因核酸疫苗和雙基因融合核酸疫苗的免疫效果，為研制高效、新型的Tp核酸疫苗提供實驗依據(jù)?！　》椒ǎ河肞CGENE軟件分析Tp外膜蛋白Gpd和

2、Tp92基因序列，設(shè)計相應特異性引物，PCR分別擴增上述兩基因1059bp和2103bp的目的基因片段，將其插入pUCm-T載體，通過藍白斑初篩，酶切分析、PCR及測序鑒定篩選陽性重組體；將Gpd和Tp92基因亞克隆至真核表達載體構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92重組體，并分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，用免疫細胞化學及westernblot鑒定其在真核細胞的表達；分別在

3、0、2、4、8w將核酸疫苗pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92、pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92及對照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)分組注射于新西蘭兔后腿股四頭肌，每次劑量為100μg，末次免疫后2w，無菌分離兔脾細胞，經(jīng)特異性重組蛋白抗原刺激后，ELISA雙抗體夾心法測定培養(yǎng)上清中IFN-γ水平，ELISA間接法測定新西蘭兔血清中抗Gpd和抗Tp92特異性抗體水平；MTT法、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗測定脾淋巴

4、細胞特異性增殖反應?！　〗Y(jié)果：成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-Gpd和pcDNA3.1(+)-Tp92單基因真核表達載體及pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92融合基因真核表達載體，三重組質(zhì)粒均能在HeLa細胞內(nèi)有效表達靶蛋白。新西蘭兔接種Gpd或Tp92單基因核酸疫苗后均能產(chǎn)生特異性抗體，6w后經(jīng)ELISA測定抗體最高滴度均達1：1024，兩組抗體A450值(0.82：0.78)無顯著性差異(P＞0.05)。新西蘭兔接種Gpd-

5、Tp92融合基因核酸疫苗后，能產(chǎn)生特異性抗體，6w后抗體ELISA最高滴度達1：1024，A450值(0.86)與兩單基因疫苗組A450值(0.82、0.76)均無顯著性差異(P＞0.05)。Gpd、Tp92單基因核酸疫苗組和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗組的兔脾淋巴細胞經(jīng)相應特異性抗原刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ均顯著升高(分別升至476±38.624pg/mL、483±38.884pg/mL、543±41.625pg/mL)，與空

6、質(zhì)粒組兔脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平(87±13.635pg/mL)之間有顯著性差異(P＜0.01)；實驗組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(49.5％、52.8％、58.5％)均高于對照組(24.6％)。Gpd、Tp92單基因核酸疫苗組和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗組兔脾淋巴細胞經(jīng)相應特異性抗原刺激后其刺激指數(shù)分別為(2.58±0.46、2.34±0.43、3.17±0.52)，均明顯高于對照組(1.57±0.28)(P＜0.05)?！　〗Y(jié)